細(xì)胞：STO細(xì)胞

中文名稱：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

生長特性：貼壁細(xì)胞

培養(yǎng)基：DMEM-H +10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

STO細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動時(shí)；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。

收到細(xì)胞后請盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長不宜超過72小時(shí)）。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

古典豬瘟病毒(CSFV)核酸擴(kuò)增檢測 （逆轉(zhuǎn)錄）

根據(jù)標(biāo)本數(shù)取0.2ml DEPC 處理的PCR反應(yīng)管，取出CSFV RT MIX室溫溶解，向反應(yīng)管中每管加入7μl CSFV RT MIX，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶系(使用前請10,000rpm瞬時(shí)離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA。1,0000rpm瞬時(shí)離心30秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：42℃ 30分鐘后98℃5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

古典豬瘟病毒(CSFV)核酸擴(kuò)增檢測（PCR擴(kuò)增）

取單管單份CSFV-PCR反應(yīng)管，加入處理后的樣品(或陰性質(zhì)控品、CSFV陽性質(zhì)控品)3μl，10,000rpm瞬時(shí)離心30s。將各反應(yīng)管做好標(biāo)記，置入PCR反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)，按照下列條件擴(kuò)增，

循環(huán)條件：94℃變性2min，93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s ，共35個循環(huán)。

古典豬瘟病毒(CSFV)核酸擴(kuò)增檢測（電泳檢測）

4.1 2%瓊脂糖凝膠配制：稀釋50×TAE（或5×TBE）至1×TAE(取20ml50×TAE，加980 ml雙蒸水至1L)或者0.5×TBE(取100ml 5×TBE，加900 ml雙蒸水至1L)，稱4g瓊脂糖放于500mL 錐形瓶中，1×TAE 或1×TBE 200 ml，置入微波爐中加熱熔解(避免加熱沸騰溶液外溢)，再加入20μl 溴化乙錠(EB)充分混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用。

4.2 電泳檢測：直接取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物15μl，用加樣槍點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm 電壓，1×TAE中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。