細(xì)胞：LA-4細(xì)胞

中文名稱：小鼠肺癌細(xì)胞

生長特性：貼壁

培養(yǎng)基：DMEM-H +10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

收到細(xì)胞后請盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長不宜超過72小時(shí)）。

LA-4細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動時(shí)；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

古典豬瘟病毒(CSFV)核酸擴(kuò)增檢測

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼m用于檢測豬血清、肺、脾、腎、腸系膜及額下淋巴結(jié)等組織標(biāo)本或病毒培養(yǎng)液中古典豬瘟病毒(CSFV)mRNA，適用于古典豬瘟病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。其檢測結(jié)果僅供參考。

實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒選取一對古典豬瘟病毒特異性引物結(jié)合一條特異性熒光探針，采用Trizol提取古典豬瘟病毒RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用生成cDNA，后者在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)作用下，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過一步PCR-熒光探針體外擴(kuò)增法對古典豬瘟病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到快速實(shí)時(shí)定量檢測之目的。

實(shí)驗(yàn)組成：

（RNA提取液B 1管 500μl/管）（逆轉(zhuǎn)錄酶系 1管 40μl/管）（Taq酶系 1管 40μl/管）

 （CSFV–PCR MIX 1管 800μl/管） （CSFV 陽性質(zhì)控品 1管 50μl/管）（陰性質(zhì)控品 1管 250μl/管）

  （DEPC水 1管 2000μl/管）

備注: RNA提取液A（Trizol reagents）等另行配備。

結(jié)果分析判定：

反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct 值在40以上，Ct值小于38個(gè)循環(huán)的為陽性；Ct值在38-40個(gè)循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后，如果Ct值仍然在38-40個(gè)循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。

【質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】

陰性質(zhì)控品：沒有熒光值增長，全部陰性。

CSFV-陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品的 Ct 值均應(yīng)小于30.0。

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足 ，否則，此次試驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。