細(xì)胞：G422細(xì)胞

中文名稱：小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

生長(zhǎng)特性：貼壁

培養(yǎng)基：1640 培養(yǎng)基  血清：10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請(qǐng)?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過72小時(shí)）。

G422細(xì)胞傳代：

1）：細(xì)胞密度約80%時(shí)，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意根據(jù)實(shí)際情況，把握消化時(shí)間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處，即可肉眼可見細(xì)胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞層吹落，吹散。

3）：取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。

（網(wǎng)絡(luò)信息主針對(duì)網(wǎng)絡(luò)推廣作用，僅供參考，細(xì)胞培養(yǎng)請(qǐng)咨詢細(xì)胞庫管理員，以細(xì)胞庫管理員提供給您的信息為準(zhǔn)，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細(xì)胞庫管理員，避免不必要的損失；）

犬細(xì)小病毒(CPV) DNA提取：

1）：血清或病毒液：取液體標(biāo)本約50μl，轉(zhuǎn)至1.5ml潔凈離心管中，加50μl核酸提取液B(DNA) 充分混勻(提取液用前需室溫溶解并充分混勻)后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

2）：心、腸、淋巴結(jié)等固體組織：取組織標(biāo)本約500mg，加入1ml生理鹽水，研磨器研磨成勻漿，取50μl勻漿液加50μl核酸提取液B(DNA) 充分混勻（提取液用前需室溫溶解并充分混勻）后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

3）：糞便或者嘔吐物：充分混勻上述標(biāo)本，3,000rpm離心1min，取上清液500μl轉(zhuǎn)至一1.5ml潔凈的離心管中，加500μl病毒濃縮液，充分混勻，13000 rpm離心3min，棄上清，沉淀加50μl核酸提取液B(DNA) 充分混勻（提取液用前需室溫溶解并充分混勻）后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

陰性質(zhì)控品：取50 μl陰性質(zhì)控品加入50μl核酸提取液B，充分震蕩。后100℃裂解10分鐘，然后13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。

CPV陽性質(zhì)控品：直接取4μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；虬凑誔CR擴(kuò)增介紹方法進(jìn)行定量分析。

【結(jié)果判定】

測(cè)定結(jié)果的計(jì)算：

如果Ct值﹤38，則實(shí)驗(yàn)樣品的CPV DNA含量(基因拷貝數(shù)/ml)= Qty-Copies/ml；

如果38﹤Ct值﹤40，為灰區(qū)建議重新檢測(cè)，重新檢測(cè)若38﹤Ct值﹤40判為陽性，否則為陰性。

如果Ct值=40，則CPV DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）﹤1×10P2PCopies/ml (低于檢測(cè)下限)。