cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉(zhuǎn)錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列。從而做cDNA克隆時應(yīng)是先從獲得mRNA開始，在此基礎(chǔ)上，通過反轉(zhuǎn)錄酶作用產(chǎn)生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以*條DNA鏈為模板復制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。

NCI-H1395細胞 細胞庫細胞種類齊全，上信息發(fā)布數(shù)量有限，為了能及時快速確認您所需要的細胞是否提供，請*時間細胞庫管理員：（，）

cDNA的甲基化

1．在cDNA樣品中加入以下試劑：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)                      5μl
5 mol/L NaCl                                2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                       2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸                    1μl
加H2O至                                  96μl
2．取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。
3．在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。
4．再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。
5．在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100 ng質(zhì)粒DNA或500 ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預實驗中用作底物以測定甲基化效率。
6．所有四份小樣實驗反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37℃溫育1h。
7．于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。
8．在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。
9．按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：
a.     在每一對照反應(yīng)中分別加入：
0.1 mol/L MgCl2                      2μl
10×EcoR I 緩沖液                    2μl
加H2O至                           20μl
b.     在2號和4號反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR I。
c.     四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
10．  微量離心機以zui大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl 70%乙醇洗滌沉淀，重復離心。
11．  用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12．  盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。

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