雞新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗體水平測定法

本次實驗的目的和要求:掌握雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法，以便檢查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
實驗內(nèi)容或原理:某些病毒(如新城疫病毒，病毒等)能夠與動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此即為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(HA)。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異免疫血清所抑制，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(HI)。
 

需用的儀器或試劑等:
動物 健康成雞2-5只，被檢雞15-25只。
器材 高壓滅菌器、濾紙、試管、試管架、離心機(jī)、離心管、三棱針、內(nèi)徑2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精燈、石蠟、96孔V型微量凝集試驗板、0.025mm微量吸液器、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。
藥劑（1）濃縮抗原；（2）生理鹽水或磷酸緩沖鹽水（PBS）；（3）Alsever細(xì)胞保存液；（4）紅細(xì)胞懸液；（5）待檢血清
 

實驗步驟
(1)發(fā)現(xiàn)與鑒定病毒：雞新城疫和病毒分離后，這些病毒能凝集雞的紅細(xì)胞，又能被特異性的已知免疫血清抑制其凝集反應(yīng)，即可鑒定此病毒。
(2)診斷病毒性疾?。喝缛⊥话l(fā)病的動物早期和恢復(fù)期血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制實驗，如抗體效價有4倍以上升高，即有診斷意義。
 

（3）免疫機(jī)體抗體效價的測定：
 

雞新城疫（ND）的HA和HI
 

（1）試驗準(zhǔn)備  
 ① 抗原：一般以雞新城疫Ⅱ系或LaUra系凍干苗作為已知抗原，進(jìn)行試驗。
 ② 0.7％細(xì)胞懸浮液：由雞翅靜脈或心臟采血，放入含有抗凝劑的滅菌試管(按每毫升血加入3.8％滅菌檸檬酸鈉0.2毫升做抗凝劑)內(nèi)，迅速混勻。如當(dāng)時不用，可直接采血放入紅細(xì)胞保存液內(nèi)(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱內(nèi)可保存兩周。
紅細(xì)胞懸液的配制：將血液注入離心管中，經(jīng)3000轉(zhuǎn)／分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的紅細(xì)胞加稀釋液(生理鹽水)洗滌。再用離心機(jī)3000轉(zhuǎn)／分鐘離心5-10分鐘，棄上清，再加稀釋液洗滌，如此反復(fù)洗滌三次，將zui后一次離心后的紅細(xì)胞泥，按0.7％的稀釋度加入稀釋液(0.7毫升紅細(xì)胞泥加99.3毫升稀釋液)。
 ③ 被檢血清：將被檢雞群編號登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內(nèi)(微量法可用孔徑2-3毫米塑料管由翅靜脈采血)，在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。每只雞應(yīng)更換一個注射器，嚴(yán)禁交叉使用。
④ 稀釋液：為滅菌的生理鹽水。
⑤ 紅細(xì)胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉(SHOO)0.80克，檸檬酸(2H20)0.055克，氯化鈉0.42克，蒸餾水加至100毫升。過濾分裝，高壓滅菌10分鐘，放4℃冰箱保存。
(2)紅細(xì)胞凝集試驗(HA)   主要是測定病毒的紅細(xì)胞凝集價，以確定紅細(xì)胞凝集抑制試驗所用病毒稀釋倍數(shù)(抗原單位)。
雞新城疫病毒的HA試驗與HI試驗現(xiàn)采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替試管。
① 首先用移液器向每個孔加入稀釋液一滴(0.05毫升)。
② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入*孔，反復(fù)抽動6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反復(fù)抽動6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0.05毫升棄去。第12孔不加病毒液為紅細(xì)胞空白對照。