微生物菌種的保藏

目的
1、了解各種保藏方法的優(yōu)缺點及其適用的目標(biāo)微生物。
2、學(xué)習(xí)并掌握幾種常用的微生物菌種保藏方法。
原理
保藏微生物菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身，而且還必須要盡可能地使菌株的遺傳性狀保持不變，同時保證其在整個保存過程中不被他種微生物污染。因此，選擇一種能夠長期有效且穩(wěn)定的保藏微生物菌種的方法事關(guān)重要。
由于微生物種類繁多，且保存方法的難易程度不同，所以微生物菌種的保藏方法亦有許多。但是不管有多少種菌種保藏方法，其基本原理都要求使微生物的代謝作用降至zui低程度，從而使其處于不活潑的狀態(tài)，即休眠狀態(tài)。就微生物本身而言，保藏就是要利用它們處于休眠狀態(tài)的孢子或芽孢而進行；而從環(huán)境條件來說，就是要選用低溫、干燥和缺氧等三個條件。以下將對幾種微生物菌種的保藏方法加以簡單介紹。
1、傳代保存法：有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是zui基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。
傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于zui適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
 一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復(fù)傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；⑤雜菌的污染機會較多。
2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優(yōu)點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。
3、載體保存法：即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如
① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基（以含水量為土壤zui大持水量的60%為宜），然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存。
 ② 砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1ml菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經(jīng)HCl預(yù)處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保藏。
③ 硅膠保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。
④ 磁珠保存法：將菌液浸入素?zé)胖椋ɑ蚨嗫撞Ａе椋┖笤龠M行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，zui后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達(dá)兩年半時間。
⑤ 麩皮保存法：在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，zui后干燥保藏。
⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進行保存。
4、懸液保存法：即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進行保存的方法。常用的有，
① 蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。
② 糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達(dá)10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，因此當(dāng)采用這種保藏方法時，應(yīng)注意以下幾點，
① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞；
② 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；
③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；
④ 在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；
⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。
⑥ 原則上應(yīng)盡快進行冷凍處理，但當(dāng)加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
⑦ 就動物細(xì)胞而言，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在－35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；
⑧ 若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；
⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。