實(shí)驗(yàn)原理
在以微生物為材料的遺傳學(xué)研究中，用某些物理因素或化學(xué)因素處理細(xì)菌，使基因發(fā)生突變，喪失合成某一物質(zhì)（如氨基酸、維生素、核苷酸等）的能力，因而它們不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，必須補(bǔ)充某些物質(zhì)才能生長(zhǎng)。這樣從野生型經(jīng)誘變篩選得到的菌株，稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。

篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株必須經(jīng)過以下幾個(gè)步驟：誘變處理、淘汰野生型、檢出缺陷型、鑒定缺陷型。由于本實(shí)驗(yàn)是以大腸桿菌為材料，所以根據(jù)細(xì)菌的特性分別說明篩選的步驟。
誘變劑的作用主要是提高突變頻率，它分為物理和化學(xué)的二類。

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物理誘變劑常用的有X射線、紫外線、快中子、γ射線等誘變處理首先是選擇誘變劑，微生物誘變中zui常用的物理誘變劑是紫外線。
誘變劑所處理的微生物，一般要求呈單核的單細(xì)胞或單孢子的懸浮液，分布均勻，這樣可以避免出現(xiàn)不純的菌落。用于誘變處理的微生物一般處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，那時(shí)的細(xì)菌對(duì)誘變劑的反應(yīng)zui靈敏。
誘變處理必須選擇合適的劑量，劑量的表示有二種，劑量和相對(duì)劑量。

劑量的單位以爾格/cm2表示，一般用相對(duì)劑量。相對(duì)劑量與三個(gè)因素有關(guān)，這三個(gè)因素是：誘變?cè)春吞幚砦⑸锏木嚯x，誘變?cè)矗ㄗ贤鉄簦┑墓β?，以及處理的時(shí)間。

前二個(gè)因素是固定的，所以通過處理時(shí)間控制誘變劑量。各種微生物的處理zui適劑量是不同的，須經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定。

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經(jīng)處理以后的細(xì)菌，缺陷型還是相當(dāng)少的，必須設(shè)法淘汰野生型細(xì)胞，提高營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所占比例，以達(dá)到濃縮缺陷型的目的。細(xì)菌中常用的濃縮法是青霉素法。

二、實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌K12的野生型菌株大腸桿菌（Escherichiacoli）K12SF+。

三、實(shí)驗(yàn)器具和藥品
1.用具：滅菌培養(yǎng)皿（9厘米），滅菌三角燒瓶（150毫升），滅菌吸管（1.5毫升），滅菌離心管。
2.培養(yǎng)基：
（1）肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸餾水100毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
（2）肉湯液體培養(yǎng)基（ZE）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸餾水50毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
（3）基本液體培養(yǎng)基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，蒸餾水98毫升，pH7.0，高壓滅菌8磅/英寸230分鐘。

青霉素是殺菌劑，它只殺死生長(zhǎng)的細(xì)胞，對(duì)不生長(zhǎng)的細(xì)胞沒有致死作用。所以在含有青霉素的基本培養(yǎng)基中野生型能長(zhǎng)而被殺死，缺陷型不能長(zhǎng)被保存得以濃縮。
檢出缺陷型的方法有逐個(gè)測(cè)定法、夾層培養(yǎng)法、*補(bǔ)給法、影印培養(yǎng)法。這里主要以逐個(gè)測(cè)定法為例進(jìn)行說明。把經(jīng)過濃縮的缺陷型菌液接種在*培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后將每一菌落分別接種在基本培養(yǎng)基和*培養(yǎng)基上。凡是在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)而在*培養(yǎng)基上能長(zhǎng)的菌落就是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
經(jīng)初步確定為營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌用生長(zhǎng)譜法鑒定。在同一培養(yǎng)皿上測(cè)定一個(gè)缺陷型對(duì)多種化合物的需要情況。

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1．酶標(biāo)抗體的制備
2．取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊，則取適當(dāng)大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50～100μm的薄組織再行固定1h～2h。
3．漂洗 以PBS液漂洗夜，換液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃夜，孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi)，底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成非特異性吸附。
5．PBS沖洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液沖洗3～4次每次10min。
8．酶標(biāo)記抗體孵育；用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃夜。
9．PBS液沖洗3～4次每次10min或4℃漂洗夜。
10．酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。
11．常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察 在經(jīng)過脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色，切片一般在2μm～4μm，切片后染色不存在通透困難的問題。無論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色，在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強(qiáng)，可減少工作量。