免疫組化試劑盒，有禮*石 蠟切片的優(yōu)點在于可以容易的存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存 一貫很重要。冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復(fù)這一步。缺點是切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。
冰凍切片由于抗原性保存比較好，所以容易出陽性結(jié)果，但是組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的保存沒有石蠟切片佳，而且抗原容易彌散，不易觀察抗原分布情況。石蠟切片由于處理的原因，抗原常被封閉甚至破壞，需要抗原修復(fù)步驟，而且不一定能修復(fù)成功。
如何選擇：
要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，一般可作冰凍切片。
選擇的時候同時看看所購抗體的說明書，看其適用于何種切片。若兩種都適合，個人認(rèn)為若染色的目的是為了看組織中有沒有該抗原，可選用冰凍切片，若想了解具體的分布情況，可選擇石蠟切片。
備注：抗體本身不可能限定一定要用冰凍切片或者一定要用石蠟切片，但抗體對2種切片都能做。這個要根據(jù)老師的目的來選擇。
抗原修復(fù)我核對過技術(shù)參數(shù)，一下附錄的4種都可以應(yīng)用，zui常見選擇方法2，但不管哪種，達(dá)到的目的一樣。不存在哪種好哪種差的疑問！
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度 免疫組化試劑盒，有禮*
1.烤片：將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化：切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修復(fù)：根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，直接進(jìn)入第5步封閉。
5.封閉：滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（選擇合理的工作比例），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；
7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
8.封閉：滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min； 免疫組化試劑盒，有禮*
9.加二抗：滴加用抗體稀釋液稀釋的*化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉：滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用試劑C稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色；
15.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；
16.封片：待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像：顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結(jié)果觀察。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。
附1：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA抗原修復(fù)液（pH8.0或9.0）等等。
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟水化處理，TBS沖洗，在組織上滴加*或*，37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可。
二、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復(fù)液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。
四、隔水式高壓抗原修復(fù)法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計時4~8 min即可關(guān)閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。
