免疫人血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性*用。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物 (即多克隆抗體)。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。我司提供完整有效的兔抗人IgG免疫血清的制備步驟。
一、實(shí)驗(yàn)材料
(一) 動(dòng)物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤。
(二) 器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號(hào)、6號(hào))、稱量瓶(10ml)、量筒、動(dòng)物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、*、黑絲線、塑料放血管等。
(三) 試劑：滅菌生理鹽水、純化人IgG(10mg/ml)、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蠟油、活卡價(jià)苗(BCG)(75mg/ml)、弗氏不*佐劑(FIA)【制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高壓滅菌后保存?zhèn)溆??！俊⒏ナ?佐劑乳化抗原(FCA-IgG)【制備：將FIA置于60℃30分鐘，吸取3ml于研缽中，逐滴加入活 BCG(75mg/ml)0.5ml及純化人IgG2.5ml,研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開(kāi)為合格】。
二、免疫方法
1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
2. *次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏*佐劑(FCA)乳化的抗原液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
3. 第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
4. 間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)(即試血)。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16 以上時(shí)才能放血。
5. 若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不*佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡(jiǎn)稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。 三、放血
(一) 心臟采用血法
1. 家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；
2. 剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
3. 用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)zui強(qiáng)的部位；
4. 用50ml注射器(連接16號(hào)針頭)，傾針45°角度，對(duì)準(zhǔn)心搏zui強(qiáng)處刺入心臟抽血致死；
5. 將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
(二) 頸動(dòng)脈放血法
1. 家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
2. 沿頸部中線切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突??； 3. 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離；
4. 于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用*夾?。?nbsp;
5. 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
6. 松開(kāi)*，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
四、分離血清 將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱內(nèi)3～4小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉)，分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 五、結(jié)果鑒定 以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià)，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。
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