溫育這一步是臨床ELISA試劑盒測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟，所以有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以知足測(cè)定要求。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測(cè)。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。使用微量加樣器加樣必需留意的樞紐點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)氣憤泡。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集，要留意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。
溫育是ELISA試劑盒測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為樞紐的一個(gè)因素。目前臨床上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很輕易泛起重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)泛起非特異吸附，從而引起非特異顯色。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值泛起：生長(zhǎng)激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式開(kāi)釋?zhuān)虼?，在測(cè)定此類(lèi)激素時(shí)，有必要在緊密親密相連的時(shí)間距離內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測(cè)定值。因此在ELISA測(cè)定中試劑的預(yù)備zui為樞紐的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。加血清樣本及反應(yīng)試劑在現(xiàn)在的ELISA試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。
臨床ELISA試劑盒測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操縱的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操縱非常簡(jiǎn)樸，一般涉及到標(biāo)本的收集保留、試劑預(yù)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判定和結(jié)果講演及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。濺出會(huì)對(duì)臨近孔產(chǎn)生污染。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相長(zhǎng)進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必需在一定的溫度前提下反應(yīng)一定的時(shí)間。
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