在6月3日到6月5日召開(kāi)的"2011干細(xì)胞技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用講座與培訓(xùn)"上，金穎教授結(jié)合自己實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)從建系、培養(yǎng)、分化三個(gè)方面由淺入深的向參會(huì)代表講解了人類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究的基本技術(shù)。
首先是建系，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的建系比小鼠胚胎干細(xì)胞的建系有明顯的不同，小鼠胚胎干細(xì)胞的建系可以直接將囊胚放在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，胚性細(xì)胞就可以直接長(zhǎng)出來(lái)，但是人類(lèi)胚胎干細(xì)胞必須人工除去滋養(yǎng)層細(xì)胞和透明帶。去滋養(yǎng)層細(xì)胞主要有兩種方法，一是機(jī)械法，二是免疫法。免疫法較為簡(jiǎn)便，機(jī)械法效果較好但對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求較高。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)盡量不要移動(dòng)，長(zhǎng)到一定程度后分塊傳代。一般采用鼠源細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞對(duì)鼠的品系要求較高，針對(duì)不同的胚胎干細(xì)胞的特性選擇不同品系鼠的細(xì)胞。飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備一般采用膠原酶和機(jī)械法結(jié)合使用的方法，但是使用純機(jī)械的方法。在培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)一些分化的細(xì)胞，這是正?，F(xiàn)象，除去這些分化細(xì)胞即可。建系成功的主要標(biāo)準(zhǔn)是核型無(wú)異常、可以傳至70-80代、可以?xún)龃婧蛷?fù)蘇、可以自我更新、有分化能力。好的胚胎干細(xì)胞系均質(zhì)、核仁較大。
在培養(yǎng)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的過(guò)程中，一般都采用鼠源的飼養(yǎng)層細(xì)胞，但是鼠源的飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)后的應(yīng)用有不良影響。所以人們?cè)谒伎际遣皇强梢韵拗骑曫B(yǎng)層細(xì)胞的分裂、不用飼養(yǎng)層細(xì)胞或是采用人源的飼養(yǎng)層細(xì)胞。但是后兩種方法都存在很大的困難，不用飼養(yǎng)層細(xì)胞的辦法現(xiàn)在只有很少的實(shí)驗(yàn)室做出來(lái)過(guò)，難以重復(fù)，細(xì)胞容易發(fā)生突變；采用人源飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法可以完成培養(yǎng)，但是難以建系。
分化是研究胚胎干細(xì)胞重要技術(shù)，主要用體內(nèi)和體外兩種方式。體內(nèi)分化一般是植入裸鼠皮下形成畸胎瘤。而體外分化則主要是采用形成擬胚體、共培養(yǎng)、無(wú)血清培養(yǎng)等方式。一般采用傳代次數(shù)較少（10代以?xún)?nèi)）的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閭鞔螖?shù)過(guò)多細(xì)胞易發(fā)生突變，影響分化能力。金穎教授特別提到分化實(shí)驗(yàn)一個(gè)很重要的因素就是細(xì)胞不能受到支原體感染，如果有支原體感染則分化實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行，大多數(shù)時(shí)候需要更換別的沒(méi)有支原體污染的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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