本世紀60至70年代對大腸桿菌的研究使之成為自然界中zui普遍為人們所認識的生物體。大腸桿菌具有兩個顯著特征：操作簡單和能在廉價的培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，它的這些特征加上十多年外源基因表達的經(jīng)驗使其在大多數(shù)科研應(yīng)用中成為表達異源蛋白zui常用的原核表達系統(tǒng)。盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。這歸因于每種基因都有其*的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質(zhì)折疊的難易程度、宿主細胞蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解、外源基因和E.coli 在密碼子利用上的主要差別以及蛋白質(zhì)對宿主的潛在毒性等等。但知識的大量積累還是有助于為表達方面某些特定的困難提供一般的解決方法。大腸桿菌作為表達系統(tǒng)的主要障礙包括：不能象真核蛋白那樣進行翻譯后修飾、缺乏將蛋白質(zhì)有效釋放到培養(yǎng)基中的分泌機制和充分形成二硫鍵的能力。另一方面，許多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物學(xué)活性，因而也就可以用大腸桿菌來表達。如何實現(xiàn)外源基因在原核細胞中的有效表達，自60年代以來，對影響外源基因在其表達體系中表達效率的各個因素作了大量實驗研究，并有多篇歸納性綜述發(fā)表[1，2，3]。國內(nèi)針對外源基因在原核細胞中表達的關(guān)鍵因素，構(gòu)建了表達載體[4]，并在此基礎(chǔ)上成功表達了一系列細胞因子的基因[5，6，7]。我們在分析了國內(nèi)外有關(guān)在原核系統(tǒng)中表達蛋白的實驗資料的基礎(chǔ)上，對在大腸桿菌中表達外源蛋白的策略所涉及的內(nèi)容進行全面的總結(jié)，以期有助于我國在這方面的研究。

1.有效表達載體的構(gòu)型

構(gòu)建表達質(zhì)粒需要多種元件，需要仔細考慮它們的組合，以保證zui高水平的蛋白質(zhì)合成。E.coli 表達載體的基本結(jié)構(gòu)[8]。

啟動子(以雜和的tac 啟動子為例)位于核糖體結(jié)合位點（RBS）上游10-100bp處，由調(diào)節(jié)基因（R）控制，調(diào)節(jié)基因可以是載體自身攜帶，也可以整合到宿主染色體上。E.coli 的啟動子由位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約35bp的六核苷酸序列（-35區(qū)）和一短序列隔開的另一六核苷酸序列（-10區(qū)）組成[9,10,11]。有許多啟動子可用于在E.coli中的基因表達，包括來源于革蘭氏陽性菌和噬菌體的啟動子。理想的啟動子具有以下特性：作用強;可以嚴格調(diào)控;容易轉(zhuǎn)導(dǎo)入其他E.coli 以便篩選大量的用于生產(chǎn)蛋白的菌株，而且對其誘導(dǎo)是簡便和廉價的[12]。在啟動子下游是RBS，其跨度約為54個核苷酸，兩端限定在 -35（±2）和mRNA編碼序列的+19到+22之間[13]。Shine-Dalgarno(SD)位點[14,15]在翻譯起始階段與16S rRNA的3’端相互作用[16]。SD與起始密碼子間的距離約為5-13bp[17]，而且此區(qū)的序列在mRNA轉(zhuǎn)錄物中應(yīng)避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，否則將會降低翻譯起始的效率[18]。在RBS的5’和3’端均為A豐富區(qū)[19]。轉(zhuǎn)錄終止子位于編碼序列的下游，作為轉(zhuǎn)錄終止的信號[20]和組成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的保護性元件，阻止核酸外切酶對mRNA的降解，從而延長mRNA的半衰期[21]。

除了上述對基因表達的效率有直接影響的元件以外，載體還含有抗生素抗性基因，以方便質(zhì)粒的篩選和傳代。氨芐青霉素是zui常用的抗性標記。但在生產(chǎn)人用治療性蛋白時，選擇其他抗性標記(如Tet)以避免可能發(fā)生的過敏反應(yīng)[22]。質(zhì)粒的拷貝數(shù)由復(fù)制起點決定。在特殊情況下，選用失控復(fù)制子能夠獲得大量的質(zhì)?？截悢?shù)和較高產(chǎn)量的質(zhì)粒編碼蛋白[23，24]。但在另外一些情況下，選用超過pBR322的高拷貝質(zhì)粒似乎并沒有好處。而且已有資料表明，增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)降低E.coli中胰酶的產(chǎn)量，在高拷貝質(zhì)粒中，強啟動子的存在嚴重影響了細胞的活性[25，26]。

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

1.啟動子

能在E.coli中發(fā)揮作用的啟動子很多。這些啟動子必須具有適合高水平蛋白質(zhì)合成的某些特性。首先啟動子的作用要強，待表達基因的產(chǎn)物要占或超過菌體總蛋白的的10-30%；第二，它必須表現(xiàn)zui低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性。若要求大量的基因表達，選用高密度培養(yǎng)細胞和表現(xiàn)zui低活性的可誘導(dǎo)和非抑制啟動子。如果所表達的蛋白具有毒性或限制宿主細胞的生長，選用可抑制的啟動子則至關(guān)重要[27，28]。例如，輪狀病毒的VP7蛋白能有效地殺死細胞，因此必須在嚴格控制的條件下表達[29]。但在某些情況下，啟動子的嚴格性并不合理，因為即使zui小量的基因產(chǎn)物也能由于其毒性而殺死細胞。如能滅活核糖體或破壞膜滲透壓的分子對細胞來說是致死性的[30]。對宿主的毒性并不于外源基因，某種自身蛋白的過量表達也能造成同樣的結(jié)果。如編碼外膜磷脂蛋白的traT基因[31]。另外，不*抑制的表達系統(tǒng)會造成質(zhì)粒的不穩(wěn)定，細胞生長速度的下降和重組蛋白產(chǎn)量的降低[32，33]。Lanzer和Bujard曾對常用的lac啟動子-操縱子系統(tǒng)進行了廣泛的研究，證明操縱子放在啟動子序列的不同位置會造成70倍差異的抑制。將17bp的操縱子置于-10和-35六聚體區(qū)之間所形成的抑制比將其放在-35區(qū)的上游或-10區(qū)的下游要高50-70倍[34]。啟動子的第三個特性是其簡便和廉價的可誘導(dǎo)性。大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)zui常用的啟動子是熱誘導(dǎo)（λPL）和化學(xué)誘導(dǎo)(trp)啟動子。異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的雜交啟動子tac[35]或trc[36]都是強啟動子，在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用很廣。但在大量生產(chǎn)人用治療性蛋白時用IPTG做誘導(dǎo)劑是不可取的，因為IPTG具有毒性而且價格昂貴[37]。IPTG的這些不足至今仍限制tac或trc強啟動子在大量生產(chǎn)人用治療性蛋白中的應(yīng)用。編碼熱敏lac阻遏蛋白[38]的突變lacI（Ts）基因的出現(xiàn)使得目前能夠?qū)@些啟動子進行熱誘導(dǎo)[39，40]。另外，還出現(xiàn)了一些新型載體，它們允許在30℃對trc啟動子進行嚴緊調(diào)節(jié)。zui近還報道了兩種不同的lac阻遏蛋白突變體，能夠同時允許熱誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)[41，42]。盡管野生型lacI基因也能熱誘導(dǎo)，但不能對其進行嚴緊型調(diào)節(jié)，且不能用于lacIq 菌株，因為溫度的變化不能遏制由lac阻遏蛋白的過量表達所造成的嚴緊性抑制[43]。因此，該系統(tǒng)只能用用于生產(chǎn)對宿主菌無害的一些蛋白。

冷反應(yīng)啟動子盡管不象其他啟動子那樣得到廣泛的研究，但已經(jīng)被證明能在低溫條件下進行有效的基因表達。噬菌體λPL啟動子的活性在20℃時zui高，隨著溫度的升高，其活性逐漸降低[44]。PL啟動子的冷反應(yīng)由E.coli整合宿主因子，一種與DNA結(jié)合的序列特異性多功能蛋白來正調(diào)控[45，46]。主要冷應(yīng)激基因cspA啟動子同樣也被證明在低溫具有活性[47]。對cspA和PL啟動子進行分子剖析，鑒定了在較低溫度下參與增強轉(zhuǎn)錄的特異性DNA區(qū)域。從而開發(fā)了一系列在20℃低溫具有高活性的PL衍生啟動子[48]。選用冷反應(yīng)啟動子的基本原理是在15-20℃的條件下，蛋白質(zhì)的折疊速度只受到輕微的影響，而作為生物化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度將被充分降低。這就為蛋白質(zhì)折疊、產(chǎn)生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合體即包涵體的形成提供了充足的時間，而目的蛋白的zui終產(chǎn)量并未減少。zui近新報道的一些啟動子具有諸多誘人之處,為選擇新的表達系統(tǒng)提供了方便。如非常強的pH啟動子[49，50],重組蛋白的產(chǎn)量可達總蛋白的40-50%[51]。但表達的水平會因不同的基因而有差異。因為蛋白質(zhì)的合成不僅依賴于啟動子的強弱，而且有賴于轉(zhuǎn)錄的效率。