如將活細(xì)胞與一定濃度的胰蛋白酶和核糖核酸酶溫育，短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、功能和活力幾乎沒(méi)有影響， 但壞死細(xì)胞以及細(xì)胞漿膜受到損傷的晚期凋亡細(xì)胞則可被這兩種酶降解，使用流式細(xì)胞儀分析，可通過(guò)提高光散射、核酸或蛋白質(zhì)熒光信號(hào)的閾值排除晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，測(cè)定早期凋亡細(xì)胞。

【材料與試劑】

（1） 含Ca2+ 和Mg2+ 的Hanks平衡鹽溶液（HBSS）：取1份A液（160g NaCl，8g KCl，2g MgSO4 ?7H2 O，2g MgCl2 ●6H2 O，2.8g CaCl2 溶于雙蒸水，定容至1000ml）和1份B液（3.04g Na2 HPO4 ?12H2 O，1.2g KH2 PO4 ，20g葡萄糖，溶于雙蒸水，定容至1000m）與18份雙蒸水混合，調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4，高壓滅菌后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/em>

（2） 0.5%胰蛋白酶，HBSS溶解后分裝，于-20℃保存。

（3） 200mg/ml核糖核酸酶，HBSS溶解后分裝，于-20℃保存。

【操作步驟】

（1） 于4℃離心收集細(xì)胞并重新懸浮于0.2ml HBSS中， 使其濃度位106 /ml；

（2） 加入100ml核糖核酸酶，混勻，37℃作用15分鐘；

（3）加入100ml胰蛋白酶，混勻，37℃作用30分鐘；

（4） 加入含10%小牛血清的HBSS，混勻，使胰蛋白酶滅活，4℃離心，去上清；

（5） 以HBSS洗細(xì)胞一次， 收集細(xì)胞并重新懸浮于HBSS中；

（6） 按本章介紹的其他方法， 進(jìn)行凋亡細(xì)胞的染色和流式細(xì)胞分析；

【結(jié)果分析】

經(jīng)過(guò)胰蛋白酶和核糖核酸酶的消化，去除了壞死的、受機(jī)械損傷的以及凋亡晚期的細(xì)胞，剩余細(xì)胞大部分是PI拒染的細(xì)胞，包括活細(xì)胞和凋亡早期的細(xì)胞。因此，本法適用于測(cè)定凋亡早期細(xì)胞以及未產(chǎn)生DNA斷裂的凋亡細(xì)胞。

【注意事項(xiàng)】

當(dāng)欲研究活細(xì)胞的表型時(shí)，要注意選擇酶消化的zui適時(shí)間， 因?yàn)橐鹊鞍酌缚赡軙?huì)使活細(xì)胞表面抗原決定簇丟失。但經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理的細(xì)胞，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，可使大部份表面抗原得以恢復(fù)。