其實還是在細(xì)胞長滿時、還沒有接觸性抑制之前傳代為好

1、預(yù)溫0.25% trypsin， 0.02%EDTA

2、用Ca－free的PBS洗滌貼壁細(xì)胞三次

3、用1份0.25% trypsin， 0.02%EDTA和3份PBS室溫下消化（不要用全量消化液因為對于細(xì)胞的懸浮作用不但未見有增強作用而且對細(xì)胞本身沒有好處）

4、在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞懸浮情況，約有半數(shù)以上細(xì)胞開始漂浮就用移液管（滴管）移出，置入離心管中

5、離心1000rpm，10min

6、上清液移回培養(yǎng)瓶中繼續(xù)消化瓶中的剩余未懸浮細(xì)胞

7、 離心管底細(xì)胞用RPMI1640重懸浮，離心1000rpm，5min去上清

8、再用10%胎牛血清的RPMI1640洗滌離心一次

9、計數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中

10、未傳代的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞＋消化液一起移入離心管中，用RPMI1640和10%胎牛血清的RPMI1640沖洗培養(yǎng)瓶各一次并將液體一并移入離心管中，吹打2次

11、離心1000rpm，5min去上清，再用10%胎牛血清的RPMI1640洗滌離心一次，計數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中（這樣就像分次收集法，如有污染也不會全軍覆沒）

12、如細(xì)胞量不夠或想盡快做完實驗去玩，留住未傳代的培養(yǎng)瓶加上全培去培養(yǎng)，因為瓶底還有細(xì)胞沒有被消化下來，這些細(xì)胞貼壁能力強增殖活力也強