逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)具有較高的靈敏性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因定量分析、生物學(xué)檢測(cè)等，此外常用逆轉(zhuǎn)錄PCR克隆目的基因。 本文主要講述了逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理、重要參數(shù)以及操作注意事項(xiàng)。
cDNA的合成是RT-PCR的重要環(huán)節(jié)。以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導(dǎo)下合成互補(bǔ)的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，則可擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的可編碼完整基因的序列。
逆轉(zhuǎn)錄PCR重要參數(shù)
不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同;因此，適合于一種mRNA拷貝的條件可能對(duì)另一種mRNA不適合。一般來(lái)說(shuō)，從事不均一mRMA群體時(shí)，所使用的條件是導(dǎo)致cDNA合成的終產(chǎn)量達(dá)到zui大，下述參數(shù)十分重要。
1.逆轉(zhuǎn)錄酶 有兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化以mRNA為模板，oligo(dT)作為引物，合成與mRNA互補(bǔ)的cDNA鏈。一種來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNA酶H活性，它zui適溫度是42℃，zui適pH8.3。在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另外，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內(nèi)切酶污染。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是單肽鏈的，有rna聚合酶活性和相對(duì)較弱的RNA酶H活性，zui適溫度37℃，zui適pH7.6，較弱的RNA酶H活性對(duì)獲得2-3kb的mRNA的全長(zhǎng)cDNA有很大好處。在*鏈反應(yīng)前可用氫氧化甲基汞處理，破壞mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這一步對(duì)于zui適反應(yīng)溫度較低(37)℃的鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)可能更為重要。臨合成cDNA*鏈之前加入過(guò)量的巰基試劑，可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。
2.單價(jià)陽(yáng)離子 離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對(duì)于cDNA長(zhǎng)度的zui適鉀離子濃度為140-150mM。
3.二價(jià)陽(yáng)離子 對(duì)于反轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)說(shuō)，二價(jià)陽(yáng)離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性;產(chǎn)生全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的zui適濃度是6-10mM。
4.脫氧核苷三磷酸 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對(duì)于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。
材料與方法
1 材料
RNA樣品
2 儀器、用具
PCR儀、電泳儀等、0.2mlPCR管(1個(gè))、移液器、碎冰
3 試劑
RNase Free dH2O;5×RT Buffer (含25mM Mg2 );dNTP (10mM each);RNase Inhibitor(10U/μl );Oligo (dT)20 (10μmol/L);ReverTra Ace
4 方法
(1) 以總RNA為模板，合成cDNA*鏈，體系如下：
(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后冰
浴5min。
注意事項(xiàng)：
① cDNA*鏈合成的反應(yīng)液冰上配制。
使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶類(lèi)時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡;由于酶保存液
中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。
逆轉(zhuǎn)錄PCR時(shí)，提取RNA是關(guān)鍵，收集RNA沉淀時(shí)，離心速度不要低于13000rpm，在離心前的沉淀也盡可能在低溫下條件下操作，此外逆轉(zhuǎn)錄酶可以選擇MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，主要是因?yàn)檫@個(gè)條件比較容易掌握。