Feulgen反應(yīng)(Feulgen reaction)是顯示DNA的zui典型的組織化學(xué)反應(yīng)，為學(xué)者Feulgen和Rossenbeck于1924年發(fā)明，簡(jiǎn)稱為Feulgen法。因?qū)NA的顯示反應(yīng)具有高度專一性，故常被用來(lái)顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的分布情況。
1．實(shí) 驗(yàn) 目 的
1．1. 熟悉并掌握Feulgen反應(yīng)的原理及其實(shí)驗(yàn)操作方法
1．2. 對(duì)細(xì)胞的免疫組化研究方法有一初步的認(rèn)識(shí)
2．實(shí) 驗(yàn) 原 理
自Feulgen等發(fā)明該顯示DNA的Feulgen反應(yīng)法以來(lái)，其作用機(jī)制也久經(jīng)研究和討論，現(xiàn)已取得一致意見(jiàn)。其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無(wú)色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團(tuán)，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說(shuō), DNA經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無(wú)色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。其反應(yīng)機(jī)制如下圖所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
3．實(shí) 驗(yàn) 用 品
3．1 器材 顯微鏡20臺(tái)、立式染色缸80個(gè)、水浴鍋1臺(tái)。
3．2 材料 香柏油5瓶，擦鏡紙5本，鑷子5把，蓋玻片20片，用carnoy’s固定液固定的肝臟和精巢切片20片。
3．3 試劑
3．3．1. schiff氏試劑 將0.5g堿性品紅置入三角燒瓶?jī)?nèi)沸騰的蒸餾水中，時(shí)時(shí)搖動(dòng)玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷卻至50℃時(shí)過(guò)濾，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃時(shí)，加入0.5g偏重亞硫酸鈉(Na2S2O3)無(wú)水亞硫酸鈉(NaHSO3)，在室溫冷暗處至少放置24h(有時(shí)需2~3天)，使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，保存于4℃冰箱中(可保存數(shù)月或更長(zhǎng)時(shí)間)。在使用前加入0.5g活性碳, 搖1min, 用粗濾紙過(guò)濾，濾液應(yīng)為無(wú)色；若液體顏色變?yōu)榉奂t色，便不能再用。
3．3．2. 亞硫酸水(洗滌劑) 用200ml普通自來(lái)水(不要用蒸餾水, 以免引起誤差)、10ml 10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3．3．3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成(應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中)。
3．3．4. 1%亮綠(light green) 亮綠1g，溶于100ml蒸餾水中。
3．3．5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。