1.外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)
　　
　　蛋白質(zhì)通常是研究的zui終目標(biāo)，因此蛋白質(zhì)的表達(dá)在基因工程中占有非常重要的地位。常用的表達(dá)系統(tǒng)有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要使用大腸桿菌，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要有酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。這些表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室條件加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹以大腸桿菌為代表的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
　　
　?。?）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：
　　
　　生物學(xué)特性和遺傳背景清楚，易于操作；
　　
　　已開(kāi)發(fā)較多的克隆載體可供選擇；
　　
　　容易獲得大量的外源蛋白（外源蛋白可占細(xì)菌總蛋白50％左右）。
　　
　　（2）蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)：
　　
　　原核細(xì)胞有其固有的RNA聚合酶，識(shí)別原核基因的啟動(dòng)子。因此，在用原核細(xì)胞表達(dá)目的基因（無(wú)論是真核基因還是原核基因）時(shí)，一般應(yīng)使用原核啟動(dòng)子。
　　
　　原核基因的mRNA含有SD序列，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成。而在真核基因上則缺乏該序列。因此，一些商品化原核表達(dá)載體上設(shè)計(jì)有SD序列，以方便真核基因的表達(dá)。
　　
　　原核細(xì)胞沒(méi)有mRNA轉(zhuǎn)錄后加工的能力。因此，在原核細(xì)胞中表達(dá)真核基因時(shí)，應(yīng)使用cDNA為目的基因。
　　
　　原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)
　　
　　進(jìn)行翻譯后加工的能力。如表達(dá)產(chǎn)物的功能和蛋白質(zhì)的糖基化、結(jié)構(gòu)的正確折疊有關(guān)，必須慎重使用原核表達(dá)系統(tǒng)。
　　
　　外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物往往在胞漿聚集，形成均一密度的包涵體。包涵體的形成有利于保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物不被胞內(nèi)的蛋白酶降解，而且可以通過(guò)包涵體和胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)密度不同來(lái)純化包涵體蛋白。但包涵體蛋白不具有該蛋白的所有生物學(xué)活性，往往需要通過(guò)變性復(fù)性的方法恢復(fù)活性，有時(shí)只能回復(fù)部分活性。
　　
　?。?）蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控
　　
　　啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的主要因素。根據(jù)啟動(dòng)子起始mRNA合成效率的不同，可分為強(qiáng)、弱啟動(dòng)子，但是啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是相對(duì)于不同基因而言的。有些啟動(dòng)子的活性可以通過(guò)物理或化學(xué)的方法誘導(dǎo)調(diào)控。在基因工程中，原核表達(dá)系統(tǒng)通常采用可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子。常用的原核啟動(dòng)子有：由異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子，由3-吲哚乙酸（IAA）誘導(dǎo)的trp啟動(dòng)子，由溫度誘導(dǎo)的PL和PR啟動(dòng)子等。噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，近年來(lái)在原核表達(dá)中得到廣泛應(yīng)用。
　　
　　SD序列是原核表達(dá)中翻譯水平的重要調(diào)控因素。SD序列和16SRNA3′端的互補(bǔ)程度、SD序列和目的基因間的距離在很大程度上影響蛋白的合成量。
　　
　?。?）蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式
　　
　　外源基因在原核細(xì)胞中可以以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表達(dá)等不同形式進(jìn)行表達(dá)。具體要根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物使用的目的和操作方法進(jìn)行選擇。
　　
　　非融合蛋白使用的外源基因必須具有從起始密碼子到終止密碼子的完整讀框。非融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和天然蛋白質(zhì)相同，是一些體內(nèi)應(yīng)用基因工程產(chǎn)品的必要條件。但是非融合蛋白在原核細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，易被降解，而且不易純化。
　　
　　融合蛋白指的是在表達(dá)產(chǎn)物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸殘基。融合蛋白使用的外源基因，必須注意其讀框和載體上原核讀框相符和。融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)較穩(wěn)定，不易被降解。而且，作為融合蛋白一部分的原核多肽往往是用于純化，或是作為檢測(cè)該融合蛋白的“標(biāo)簽（tag）”。如本實(shí)驗(yàn)中采用金屬螯合親和層析技術(shù)純化帶6個(gè)His標(biāo)簽的融合蛋白。
　　
　　分泌型表達(dá)指的是在細(xì)胞漿內(nèi)合成的多肽進(jìn)入內(nèi)膜和外膜的周間質(zhì)。進(jìn)行分泌型表達(dá)時(shí)，要將一段原核或真核的信號(hào)肽序列連接在待表達(dá)基因的上游。常用的信號(hào)肽有ompT、phoA、pelB等，在表達(dá)的蛋白進(jìn)入細(xì)胞周間質(zhì)時(shí)，信號(hào)肽被蛋白酶水解，產(chǎn)生游離的表達(dá)產(chǎn)物。因此，分泌型表達(dá)可以保護(hù)外源蛋白不被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，增加表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，同時(shí)，表達(dá)蛋白的生物活性較好，易于純化，但是，表達(dá)量往往比較低。
　　
　　2.乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　
　　操縱子是原核細(xì)胞基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。通常由兩個(gè)以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動(dòng)子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A和操縱序列、啟動(dòng)子、CAP結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列組成（如圖1）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和降解物阻遏作用
　　
　　乳糖操縱子的調(diào)節(jié)包括乳糖（或IPTG）的誘導(dǎo)效應(yīng)和葡萄糖的降解物阻遏效應(yīng)。
　　
　?。?）乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)
　　
　　當(dāng)沒(méi)有乳糖存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因lacI表達(dá)，轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結(jié)合，阻礙了結(jié)合在旁邊啟動(dòng)子的RNA聚合酶向前移動(dòng)，使目的基因（本實(shí)驗(yàn)中目的基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因）不能轉(zhuǎn)錄，也就不能翻譯出目的蛋白。也就是說(shuō)，當(dāng)沒(méi)有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)（如圖2）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和降解物阻遏作用當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖，異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，而不能結(jié)合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動(dòng)子向3′端移動(dòng)，于是，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子被誘導(dǎo)（如圖3）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和降解物阻遏作用乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物。由于IPTG不會(huì)被分解，它的誘導(dǎo)作用是持久的。
　　
　?。?）乳糖操縱子的降解物阻遏
　　
　　當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細(xì)菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（catabolicrepression）。
　　
　　降解物阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又稱cAMP受體蛋白（cAMPReceptorProtein，CRP），屬于一種激活蛋白，對(duì)乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。CAP分子內(nèi)同時(shí)具有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉(zhuǎn)錄。
　　
　?。?）阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)
　　
　　當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒(méi)有CAP存在時(shí)，即使沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。只有在CAP存在且沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時(shí)，或者說(shuō)只有高乳糖低葡萄糖時(shí)，操縱子發(fā)揮zui大轉(zhuǎn)錄活性。這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對(duì)碳源的優(yōu)先利用相一致。
　　
　　本實(shí)驗(yàn)使用的表達(dá)載體p32aGFPuv上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列，目的基因表達(dá)的是帶6XHis（組氨酸標(biāo)簽）的重組綠色熒光蛋白。在IPTG的誘導(dǎo)下，融合蛋白表達(dá)可增強(qiáng)105倍，并且可用金屬鰲合親和層析分離純化，zui終獲得純的重組綠色熒光蛋白。
　　
　　【試劑與器材】
　　
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　　1.LB液體培養(yǎng)基2L
　　
　　2.10mg/mL氨芐青霉素溶液10mL（全班共用）
　　
　　3.100mmol/LIPTG溶液10mL（全班共用）
　　
　　4.20%葡萄糖溶液10mL（全班共用）
　　
　　5.超聲平衡緩沖液：50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaClpH7.0500mL
　　
　　（二）器材
　　
　　超凈工作臺(tái)、恒溫振蕩器、臺(tái)式高速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、低溫?fù)u床、高壓破碎儀或超聲破碎儀等。
　　
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　　工程菌BL21(DE3)pET-32a和工程菌BL21(DE3)p32aGFPuv。
　　
　　【操作方法】
　　
　　1.分別挑取工程菌BL21(DE3)pET-32a和BL21(DE3)p32aGFPuv的單菌落接種到5mLLB液體培養(yǎng)基（含氨芐，終濃度為100μg/mL，以下同）。
　　
　　2.于37℃、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜（12h－14h）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
　　
　　3.取三支滅菌試管，各加入5mLLB液體培養(yǎng)基(含氨芐），分別編號(hào)為1#，2#，3#，另外取裝于500mL三角瓶中的150mLLB液體培養(yǎng)基（含氨芐），編號(hào)6#，全部按1：50的比例接種。1#接種100μLBL21(DE3)pET-32a，2#接種100μLBL21(DE3)p32aGFPuv，3#接種100μLBL21(DE3)p32aGFPuv，6#接種3mLBL21(DE3)p32aGFPuv。
　　
　　4.于37℃、250r/min培養(yǎng)約2h－3h。
　　
　　5.誘導(dǎo)處理：1#、2#不需處理；3#加入20％葡萄糖100μL至終濃度為0.4％，加入5μL100mmol/LIPTG至終濃度為0.1mmol/L；6#加入100mmol/LIPTG約150μL至終濃度為0.1mmol/L。
　　
　　6.于21-25℃、250r/min培養(yǎng)約10h－12h或過(guò)夜。
　　
　　7.收菌（注意采集標(biāo)本并編號(hào)）：①?gòu)?#三角瓶培養(yǎng)的150mL菌液中取出5mL置于一支試管中（編號(hào)為4#）。②分別從1#，2#，3#培養(yǎng)物各取100μL于EP管用于SDS-PAGE。③將1#，2#，3#，4#試管中的菌液分別收集到4個(gè)1.5mLEP離心管中，編上相應(yīng)編號(hào)。1#，2#，3#離心棄上清；4#上清收集到另一個(gè)EP管，編號(hào)為5#。④6#三角瓶中剩余菌液用50mL離心管于5000r/min，4℃，離心10min，棄上清收集菌體。
　　
　　8.于紫外燈下觀察1#-5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光（熒光強(qiáng)弱），記錄觀察到的現(xiàn)象，并拍照。
　　
　　9.6#收集的全部菌體用50mL超聲平衡緩沖液重懸（50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaClpH7.0)。
　　
　　10.超聲波破菌或高壓破菌，然后用50mL離心管于8000r/min，4℃，離心40min，取上清（棄沉淀）。上清可保存于-20℃冰箱，作下一步親和層析實(shí)驗(yàn)用。
　　
　　超聲操作：冰浴下進(jìn)行，功率為400W，工作4s，間隙4s，為一次，99次為一周期。共處理六周期。
　　
　　高壓破碎操作：壓力約為150MPa。注意根據(jù)裂解液渾濁程度控制流速，1drops/1~4seconds。
　　
　　【注意事項(xiàng)與提示】
　　
　　1.本實(shí)驗(yàn)的目的是比較重組DNA在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)是否受IPTG和葡萄糖存在的影響，所以1#、2#管的細(xì)菌在25-28℃培養(yǎng)時(shí)不加IPTG和葡萄糖，3#管除加IPTG外還加入葡萄糖，糖的濃度要大于0.2%以上（本實(shí)驗(yàn)采用0.4％）。4#三角瓶細(xì)菌僅加IPTG也僅指這次實(shí)驗(yàn)所用的重組DNA菌體而言。有的重組DNA菌體在其表達(dá)時(shí)除需加IPTG外仍需加入少量的葡萄糖為碳源作誘導(dǎo)。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時(shí)要注意各管編號(hào)要相應(yīng)對(duì)好，不能混亂。
　　
　　2.不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到IPTG濃度和溫度的影響，采用不同溫度或不同濃度的IPTG來(lái)誘導(dǎo)，觀察哪種溫度或哪種濃度條件下其蛋白表達(dá)量zui大。在科研中一般都要求這樣做。
　　
　　3.由于本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的目的蛋有綠色熒光蛋白，其在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光。離心后收集的菌體在紫外線的照射下都可見(jiàn)黃綠色熒光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光及其熒光的強(qiáng)弱，就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度。
　　
　　【實(shí)驗(yàn)安排】
　　
　　1.*天晚上9時(shí)左右活化種子菌。
　　
　　2.第二天上午配制培養(yǎng)基及滅菌，下午至晚上做放大接菌和誘導(dǎo)。
　　
　　3.第三天上午收菌、觀察、拍照、破碎菌體、離心收集蛋白。
　　
　　【實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題】
　　
　　1.對(duì)紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。
　　
　　2.為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時(shí)加入IPTG？
　　
　　3.大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些因素的影響？