一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念
(一)DNA克隆

克隆(clone)：來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。

克隆化(cloning)：獲取同一拷貝的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。

1.分子克隆(DNA克隆)

2.細(xì)胞克隆

3.個(gè)體克隆(動(dòng)物或植物)

DNA克?。?/em>

應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的DNA與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子。又稱基因克隆或重組DNA。

基因工程：

實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作，又稱為重組DNA技術(shù) (recom-binant DNA technology)。

(二)工具酶

1.限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)

識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為I、II、III三類。II類酶識(shí)別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)。

限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端：鈍性末端(blunt end)粘性末端(sticky end)

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為4~8個(gè)bp。不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍末端(compatible end)，可用連接酶連接。

2.DNA聚合酶I

3.逆轉(zhuǎn)錄酶

4.DNA連接酶

5.堿性磷酸酶

6.末端轉(zhuǎn)移酶

7.Taq DNA聚合酶

(三)目的基因

應(yīng)用重組DNA技術(shù)所要分離、獲得的基因。

1.cDNA(complementary DNA):是指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的，與RNA互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板，經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

2.基因組DNA(genomic DNA)：是指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

(四)基因載體(vector)

能攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖所采用的可獨(dú)立復(fù)制的完整DNA分子。又稱克隆載體。其中為表達(dá)出蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的載體又稱表達(dá)載體。

常用的載體：質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒DNA載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)： 能自主復(fù)制;

具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定;

有克隆位點(diǎn)(外源DNA插入點(diǎn))，常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn);

分子量小，以容納較大的外源DNA。

1.質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù) 千堿基對(duì)。常有 1 ~ 3個(gè)抗藥性 基因，以利于篩 選。

2.噬菌體(phage)DNA

λ 噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λ gt 系列(插入型，適用cDNA克隆)

EMBL系列(置換型，適用基因組克隆)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)(含lac Z基因)

M13mp系列

pUC系列

3.其他

柯斯質(zhì)粒(cosmid)

酵母人工染色體載體(yeast artificial chromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體(如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)

二、重組DNA技術(shù)基本原理

(一)目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:用于已知序列，或可推導(dǎo)出序列的基因

2.基因組DNA

基因組DNA文庫(kù)(genomic DNA library):存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。簡(jiǎn)稱G-文庫(kù)。

3.cDNA:

cDNA文庫(kù)(cDNA library)用細(xì)胞總mRNA 制備全套雙鏈cDNA后，建立的基因文庫(kù)。簡(jiǎn)稱 c-文庫(kù)。

4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是根據(jù)DNA復(fù)制的原理，在體外利用酶促反應(yīng)獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)。

PCR的反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2++的緩沖液。

PCR的基本反應(yīng)步驟：

1.變性：將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至95℃ ，使模板DNA*變性成為單鏈;

2.退火：將溫度下降至50℃左右，使引物與模板DNA退火結(jié)合;

3.延伸：將溫度升至72℃ ，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。

上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)25～30次循環(huán)后，可將模板DNA擴(kuò)增達(dá)百萬(wàn)倍。

(二)克隆載體的選擇

(三)外源基因與載體的連接

1.粘性末端連接

2.平端連接

限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端粘端經(jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉?/em>

3.同聚物加尾連接

由末端轉(zhuǎn)移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。

4.人工接頭

由平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進(jìn)行連接。

(四)重組DNA導(dǎo)入受體菌

受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染(transfaction)

感染(infection)

(五)重組體的篩選

重組DNA導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來(lái)，這一過(guò)程即為篩選(screening)或選擇(selection)。

1.直接選擇法：針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。其特點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型。

抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)：將目的基因插入帶ampr和tetr基因載體的tetr基因中，則tetr基因失活。在分別含有氨芐青霉素和含四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選。

標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)

若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá) 產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，就可利用對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的依賴表型來(lái)篩選。

分子雜交法：利用32P標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的轉(zhuǎn)化子DNA或克隆的DNA片段進(jìn)行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。

原位雜交

Southern印跡

2.非直接選擇法：

免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選。包括：

免疫化學(xué)方法

酶免檢測(cè)法

(六)克隆基因的表達(dá)

表達(dá)體系的建立：

表達(dá)載體的構(gòu)建

受體細(xì)胞的建立

表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化

1.　原核表達(dá)體系

E.coli的標(biāo)準(zhǔn)：

選擇標(biāo)志

強(qiáng)啟動(dòng)子

翻譯調(diào)控序列

多接頭克隆位點(diǎn)

E.coli的不足：

缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制

缺乏翻譯后加工機(jī)制

表達(dá)產(chǎn)物形成不溶性包涵體

很難表達(dá)大量可溶性蛋白

2.　真核表達(dá)體系

如酵母、昆蟲及哺乳類動(dòng)物細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)積累

缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)

轉(zhuǎn)染：將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程

三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

疾病基因的發(fā)現(xiàn)

發(fā)展生物制藥

DNA診斷

基因治療

遺傳疾病的預(yù)防