1 實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)的方法學(xué)

1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在 real-time 技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉 的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。

pcr反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，zui終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的zui終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和zui終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板zui初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) （baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義 樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。

1.2 熒光化學(xué) 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類。

擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種zui簡(jiǎn)單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR green 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí) 也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引 物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。

擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策 略。目前在real-time Q-PCR中zui廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。pcr擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分 別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，此時(shí)5′端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET），因 此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5′端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下， 沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基 團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn) 了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。