1、將重組質(zhì)粒（BL21-2?2或Rossatta-2?2）的表達(dá)菌37℃搖培過夜后，1：20擴(kuò)配（約需1h15m）；

2、至OD600=0.5~0.7時(shí)（約1h15min~1h45min），在15-（0.5-24，0.8-12）；20-（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，具體條件根據(jù)搖床使用情況而定；

3、對(duì)誘導(dǎo)后的菌液4℃，4000g，20min，*去上清；離心前取2ml以備用于總蛋白電泳分析S1；

4、細(xì)菌沉淀用BindingBuffer（無尿素，20mM咪唑）懸浮，100ml用5~10ml緩沖液（約當(dāng)2~5ml每克菌量），視懸浮后的菌液濃度而定；

5、反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞：做到14步時(shí)由于時(shí)間原因不能立即繼續(xù)后面的操作，可將菌懸液放于-70℃冰箱中冷凍；也可用反復(fù)凍融的方法來破碎細(xì)胞，在-70℃凍融，在室溫下溶解，反復(fù)凍融3~4次；

6、加Lysozyme至1mg/ml（1ml加10ul），在冰上孵育30min~1h；

7、200~300W超聲破碎，2s×30次，停頓2s；若菌種較多可以增加破碎次數(shù)。注意超聲破碎時(shí)間，不可太長(zhǎng)，否則溫度升高易導(dǎo)致蛋白變性；而時(shí)間太短則破碎不*，蛋白無法釋放出來；

注意：第7步可選作，若經(jīng)過凍融及溶菌酶處理后的菌懸液比較澄清，則可不用超聲破碎。

8、4℃，10000rpm20~30min，取上清；將沉淀用變性的BindingBuffer（8M尿素）懸浮，然后室溫?fù)u動(dòng)30min，取40ul進(jìn)行電泳樣制備S2；

9、4℃，10000rpm10min，對(duì)上清再離心一次，取40ul進(jìn)行電泳樣制備S3；

10、上清通過0.45um的細(xì)菌過濾器，取40ul進(jìn)行電泳樣制備S4；

11、用HisTrap純化：

a）洗柱：用5倍柱床體積（5ml）純水洗柱，避免產(chǎn)生氣泡。

b）平衡：至少5mlBindingBuffer（20mM咪唑），一般10ml，流速在1ml/min。

c）上樣：流速要慢要，控制在1ml/min，并收集流出的蛋白液，取40ul進(jìn)行電泳樣制備S5；

d）重新上樣：對(duì)*次上樣流出的蛋白液再進(jìn)行過柱一次，取40ul進(jìn)行電泳樣制備S6；

e）平衡：用10mlBindingBuffer（20mM咪唑），收集*管及zui后一管，各取40ul進(jìn)行電泳樣制備S7，S8。

f）洗脫：用5mlElutionBuffer（500mM咪唑）洗脫，每1ml一管，一般*二管中蛋白多。

g）平衡：用5ml的BindingBuffer（20mM咪唑）平衡柱子；

h）封閉：用20%的乙醇封閉柱子，4℃保存。

若需進(jìn)行咪唑濃度優(yōu)化，則純化步驟改為：

10、4梯度咪唑濃度洗脫：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500mM的咪唑進(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度各用4ml，收集第2、3V；電泳分析后確定*的咪唑平衡及洗脫濃度。

12、樣品處理：吸取純化后的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上樣緩沖液，100℃水浴5min，12，000rpm離心3min后取上清點(diǎn)樣，每個(gè)加樣孔15ul。

13、80V電泳2h左右，取出膠用染色液染色4~5h（回收的染色液可過夜），用脫色液脫色3次，觀察拍照。

附：

1、總蛋白電泳方法：700ul，12000g離心5min，棄上清，加入50霯1×蛋白上樣緩沖液，充分懸浮，煮沸5min，12000g離心5min；

2、構(gòu)建好的載體在進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)前，應(yīng)選取10個(gè)左右的單克隆進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)的小量試驗(yàn)，對(duì)誘導(dǎo)后的總蛋白進(jìn)行電泳分析，選取表達(dá)量zui大的克隆保存（甘油菌，-70℃冰箱）；

3、從-70℃冰箱中活化菌進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)時(shí)，活化好的表達(dá)菌在4℃冰箱僅可存放15天左右，zui多1個(gè)月，過期后必須重新劃線活化。4℃冰箱保存的宿主菌每次用過后必須用封口膜封好。

4、SDS-PAGE分析的蛋白樣：總蛋白樣S1，沉淀中的蛋白樣S2，離心后上清中的蛋白樣S3，過細(xì)菌過濾器后的蛋白樣S4，*次上柱時(shí)流出的蛋白樣S5，第二次上柱時(shí)流出的蛋白樣S6，20mMBingdingbuffer過柱后的*管S7和zui后一管蛋白樣S8。