三種不同的核酸酶——s1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶Ⅶ被用來進(jìn)行RNA定量，確定內(nèi)含子位置，以及用來鑒定在克隆的DNA模板上的mRNA 5′端和3′端的位置。當(dāng)檢測(cè)RNA被雜交到DNA模板上時(shí)，用核酸酶S1進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)的分析;當(dāng)檢測(cè)RNA被雜交到來自DNA模板的RNA上時(shí)用RNA酶。外切核酸酶Ⅶ有更專一的用途——對(duì)短的內(nèi)含子作圖并解決S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)中出現(xiàn)的異常情況。

這三種酶的使用方法是Berk和Sharp(1977)提出的經(jīng)典S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)技術(shù)的改良。含有目的mRNA的RNA樣品與互補(bǔ)的DNA或RNA探針在利于形成雜合體的條件下溫育。在反應(yīng)的末期，一種酶用來降解未雜合的單鏈RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA雜合體用凝膠電泳分離，接著用自顯影或southern雜交來觀察。當(dāng)探針的摩爾數(shù)在雜交反應(yīng)中過量時(shí)，信號(hào)的強(qiáng)度和樣品中的目的mRNA的濃度成正比。用過量探針與一系列定量靶序列雜交作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而準(zhǔn)確估算樣品濃度。S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)的zui初模式中一個(gè)主要的問題是用雙鏈DNA作為探針。為防止探針DNA在雜交一步重新結(jié)合，理想的情況是建立有利于形成RNA-DNA雜合體遠(yuǎn)甚于形成DNA-DNA雜合體的反應(yīng)條件，但并不總是可行。因?yàn)镈NA-RNA雜合體比DNA-DNA雜合體略微穩(wěn)定，復(fù)性條件一般是含80%甲酰胺、溫度高于雙鏈DNA熔點(diǎn)的計(jì)算值。然而，在這種條件下，雜交速度降低約10倍，而且DNA-RNA雜體產(chǎn)物的穩(wěn)定性也不確定。使用單鏈探針則可以解決這些問題。復(fù)性可以在正常的雜交條件下進(jìn)行，因?yàn)闆]有互補(bǔ)的單鏈和靶RNA競(jìng)爭(zhēng)探針。但是當(dāng)Berk和Sharp進(jìn)行研究時(shí)，還沒有可靠的方式去除其互補(bǔ)部分的單鏈DNA。鏈分離凝膠電泳是那時(shí)惟一可行的方式，但它始終是一種技巧性很強(qiáng)、難于掌握的技術(shù)。只有70%的DNA片段可以得到分離，而且即使在相當(dāng)成功的條件下，樣品中也不可避免的污染互補(bǔ)DNA單鏈。直到20世紀(jì)80年代后期，通過制造有高度特異活性的標(biāo)記單鏈DNA或RNA探針才解決了這一問題。

S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)中使用的探針通常是由雙鏈DNA兩條鏈分離得到的，已知極性且特異性高?；蛘吒毡榈?，從頭合成與雙鏈DNA模板的一條鏈互補(bǔ)的RNA或與單鏈模板互補(bǔ)的DNA。

鏈分離的探針通過同時(shí)或依次使用兩種Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶預(yù)處理，產(chǎn)生在5′端和3′端各有一段突出的合適大小的DNA片段(通常100~500個(gè)核苷酸)。因此該片段的一條鏈zui多可以比另一條鏈長(zhǎng)8個(gè)核苷酸。在變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳已足夠分離這種差異的兩條鏈。在電泳前或電泳后，目的單鏈的5′端被去磷酸化并從[γ-32P]得到標(biāo)記的磷酸基團(tuán)，從而在體外被標(biāo)記，T4噬菌體多核苷酸激酶催化這一反應(yīng)。

從頭合成探針法用來體外產(chǎn)生末端標(biāo)記或均勻標(biāo)記的DNA探針。末端標(biāo)記的探針通過將寡核苷酸引物的5′端磷酸化而得到。均勻標(biāo)記的探針通過放射標(biāo)記的核苷酸引入正在合成的DNA單鏈得到。在兩種情況下，通過一種可識(shí)別新合成的雙鏈DNA上特異位點(diǎn)的限制性酶酶切，分離新合成的DNA鏈和模板。接下來可以用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離放射性標(biāo)記的探針和線性化的單鏈DNA。