在pH值為12.0～12.6的堿性環(huán)境中，在去垢劑SDS的作用下，細菌的細胞壁與細胞膜均破裂，釋放出大量的染色體DNA、RNA及質(zhì)粒DNA。此時，所有雙鏈DNA解聚成單鏈，但質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀。當pH值恢復(fù)到中性時，在高鹽濃度下，大分子量的染色體DNA只是部分復(fù)性，相互交織成不溶性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與細胞碎片、部分蛋白質(zhì)和大分子量的RNA一起沉淀，并可通過離心除去。而環(huán)狀的質(zhì)粒DNA可以*復(fù)性，溶解于上清中，從而達到初步分離的目的。
　　本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其他細菌成分去除，zui后以低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

【操作步驟】
　　1．取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，12000 rpm，離心30s，棄上清，盡可能倒干，收集菌體沉淀。
　　2．用100μl 溶液I（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）重懸菌體沉淀，Tip吹打至*懸浮。
　　3．加入150μl 溶液II（0.2mol/L NaOH, 1% SDS），輕輕顛倒混勻4~6次，使充分菌體充分裂解，室溫放置5 min，直至溶液變得清亮。
　　4．加入150μl 溶液III（4mol/L 鹽酸胍，0.5mol/L KAc pH4.2），立即溫和顛倒混勻4~6次。室溫放置5 min，12000 rpm離心10 min，小心吸取上清。
　　5．加入400μl 結(jié)合緩沖液（5mol/L 鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl pH6.6, 37.5%乙醇）于離心吸附柱中，然后將步驟4中的上清加入吸附柱中（不要將沉淀移入吸附柱），混勻,套入收集管中，12000 rpm離心30 s，倒掉收集管中的廢液。
　　6．加入750μl 漂洗液（20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇）于離心吸附柱中，靜置1min ，12000 rpm離心15 s，倒掉收集管中廢液。
　　7．重復(fù)步驟6一次。
　　8．再次于12000 rpm空離心2 min, 盡量除去漂洗緩沖液中的乙醇。
　　9．取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5ml Eppendorf管中，在硅基質(zhì)膜中央部位加入50μl洗脫緩沖液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0)，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。
　　10．丟棄離心吸附柱，溶液中含有目的質(zhì)粒DNA，置于4℃或－20℃保存。

【注意事項】
　　1． 所用器具必須嚴格清洗，zui后要用雙蒸水沖洗3次，凡可以進行滅菌的試劑與器具都要經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，防止外源性核酸酶對DNA的降解以及其他雜質(zhì)的污染。
　　2． 細菌培養(yǎng)容器用三角燒瓶，其容量至少應(yīng)為培養(yǎng)液體積的四倍，從而保證氧氣的供應(yīng)。細菌培養(yǎng)不要超過16 h，否則細菌會崩解，引起細菌大量死亡，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。
　　3． 溶液I在用前加入RNase A，并置于4℃保存。
　　4． 在堿裂解提質(zhì)粒的方法中，關(guān)鍵之一是加入溶液III的時機，這決定了DNA變性與復(fù)性的時間。既要使溶液II 與染色體DNA充分作用使之變性，又要保證質(zhì)粒DNA不會因作用時間過久而發(fā)生不可逆的變性。若質(zhì)粒變性過度，將引起提取效率下降、內(nèi)切酶切割困難等一系列問題。因此，加入溶液II切忌劇烈振蕩，時間不應(yīng)超過5 mins。
　　5． 加溶液溶液III離心后，倘若上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
　　6． 本試劑盒優(yōu)點：快速、方便；產(chǎn)量高、純度好；毒性低：采用硅基質(zhì)膜離心柱純化質(zhì)粒DNA，不需酚、氯仿抽提。