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常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定的載體和導(dǎo)入方法,基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi),并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染方法有多種,根據(jù)不同的細(xì)胞,貼壁或懸浮細(xì)所可選用不同的方法,其目的是要達(dá)到設(shè)置轉(zhuǎn)染效率,影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種,包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度、靶細(xì)胞的生長狀態(tài)等,下面重點介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術(shù):
被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,其生長狀態(tài)如何,將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長的細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜,轉(zhuǎn)染當(dāng)日,在轉(zhuǎn)染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細(xì)胞,也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。
用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其了化學(xué)物質(zhì)的污染,OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。應(yīng)用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn),目前大多采用進(jìn)口的術(shù)提取純化試劑盒。
具體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后,一般在轉(zhuǎn)染后48小時,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?8小時后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測等實驗。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,則可對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物,zui常用的直核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。
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