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將連接有所需要的DNA的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法有四種:
①轉(zhuǎn)化,用質(zhì)粒作載體所常用的方法。
②轉(zhuǎn)染(見轉(zhuǎn)化),用噬菌體DNA作載體所用的方法,這里所用的噬菌體DNA并沒有包上它的外殼。
③轉(zhuǎn)導(dǎo),用噬菌體作載體所用的方法,這里所用的噬菌體DNA被包上了它的外殼,不過這外殼并不是在噬菌體感染過程中包上,而是在離體情況下包上的,所以稱為離體包裝。
④注射,如果宿主是比較大的動植物細(xì)胞則可以用注射方法把重組DNA分子導(dǎo)入。
外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。早在1943年,Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低,在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞,經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA,稱為感受態(tài)細(xì)胞,再與外源DNA接觸,就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理,就成為感受態(tài)細(xì)菌,當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時間處理,質(zhì)粒dna就能進(jìn)入細(xì)菌;用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率,這稱為電穿孔(electroporation)轉(zhuǎn)化法。
噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌,病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染(infection)。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體,以其DNA與目的序列重組后,在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒,就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞,使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高,但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。
重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌,即宿主菌先經(jīng)過CaCl2、電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA,進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖,這種方式稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。M13噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌就常用轉(zhuǎn)染的方法。重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞也常用轉(zhuǎn)染方式。zui經(jīng)典的是1973年建立的磷酸鈣法,其利用的基本現(xiàn)象是:DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時,培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力,但所用外加電場的強(qiáng)度、電脈沖的長度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。近年來用人工脂質(zhì)膜包裹DNA,形成的脂質(zhì)體(Liposome)可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞,方法簡單而有效,現(xiàn)有商售的脂質(zhì)體試劑,使用日益廣泛。
用以上任何一種方法連接起來的DNA中既可能包括所需要的DNA片段,也可能包括并不需要的片段,甚至包括互相連接起來的載體分子的聚合體。所以接受這些DNA的宿主細(xì)胞中間只有一小部分是真正含有所需要的基因的。一般通過3種方法可以取得所需要的宿主細(xì)胞:
①遺傳學(xué)方法,對于帶有抗藥性基因的質(zhì)粒來講,從被轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否由敏感狀態(tài)變?yōu)榭顾幍臓顟B(tài)就可以知道它有沒有獲得這一抗藥性質(zhì)粒。一個抗藥性基因中間如果接上了一段外來的DNA片段,就使獲得這一質(zhì)粒的細(xì)菌不再表現(xiàn)抗性。把一個帶有兩個抗性基因氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性的質(zhì)粒pBR322用限制酶Bam HI處理,由于Bam HI的*的識別位點是在四環(huán)素抗性基因中,所以經(jīng)同一種酶處理的DNA分子片段就可以連接在這一基因中間。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中選擇只對氨芐青霉素具有抗性而對四環(huán)素不具抗性的細(xì)菌,便可以獲得帶有外來DNA片段的載體的細(xì)菌。這是一種常用的遺傳學(xué)方法。
②免疫學(xué)方法和分子雜交方法,當(dāng)一個宿主細(xì)胞獲得了攜帶在載體上的基因后,細(xì)胞中往往就出現(xiàn)這一基因所編碼的蛋白質(zhì),用免疫學(xué)方法可以檢出這種細(xì)胞。分子雜交的原理和方法同樣可以用來檢測這一基因的存在(見分子雜交、基因文庫)。
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