1導(dǎo)論
　　
　　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是美國(guó)Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳研究室MullisK.B.等人于1985年發(fā)明的一種快速體外DNA片段擴(kuò)增技術(shù)，是八十年代分子生物學(xué)資源領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破，被譽(yù)為分子生物學(xué)資源發(fā)展*的又一里程碑。該技術(shù)一問(wèn)世，就在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等領(lǐng)域得到快速而廣泛的應(yīng)用，并且對(duì)已建立的基因克隆、DNA序列分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展也起了巨大的推動(dòng)作用。
　　
　　PCR技術(shù)是一種模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的體外酶促合成特異性核酸片段技術(shù)（亦稱無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。它以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，由一對(duì)人工合成的寡核苷酸作為介導(dǎo)，通過(guò)DNA聚合酶促反應(yīng)，在體外進(jìn)行特異DNA序列擴(kuò)增。其過(guò)程包括模板變性（deNature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在內(nèi)的重復(fù)循環(huán)系列，使末端被引物5’端限定的特異性片段成指數(shù)形式累積。由于在每一循環(huán)中合成的引物延伸產(chǎn)物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶DNA的拷貝數(shù)幾乎呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。因此20次PCR循環(huán)將產(chǎn)生約一百萬(wàn)倍（220）的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且具有從DNA粗制品和降解的DNA模板中擴(kuò)增靶序列的能力，這一點(diǎn)在生藥鑒定應(yīng)用中尤為重要。
　　
　　PCR的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，關(guān)鍵是運(yùn)用兩個(gè)起始引物，分別為待擴(kuò)增序列的相對(duì)的兩條單鏈DNA結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別位于待擴(kuò)增序列的兩端，并且3’端相對(duì)，然后利用dna聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制，在兩個(gè)引物之間誘發(fā)聚合酶反應(yīng)。PCR反應(yīng)可以簡(jiǎn)述如下：
　　
　　在微量離心管中加入適量緩沖液，加微量模板DNA，四種脫氧單核苷酸（dNTP），耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成DNA引物，并有Mg2+存在。
　　
　　1、加熱使模板DNA在高溫下（95℃左右）變性，雙鏈DNA解開(kāi)而變成單鏈DNA游離于溶液中。這是所謂變性階段。
　　
　　2、PCR的引物是兩段人工合成的寡核苷酸鏈，長(zhǎng)度為16－24個(gè)核苷酸殘基，其順序由被擴(kuò)增的DNA片段兩端的序列決定。這兩段寡核苷酸鏈分別與模板DNA的正鏈和負(fù)鏈互補(bǔ)，所互補(bǔ)的位點(diǎn)一個(gè)在被擴(kuò)增序列的“上游”，一個(gè)在被擴(kuò)增序列的“下游”。高溫使模板DNA變性成單鏈以后，溫度降低，由于pcr反應(yīng)體系中引物的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于模板DNA的拷貝數(shù)，因而引物與模板DNA形成復(fù)合物的機(jī)率要大大高于模板DNA兩條單鏈的重新結(jié)合。只要嚴(yán)格地控制復(fù)性的條件，復(fù)性過(guò)程是傾向于形成引物與模板的復(fù)合物的。這是退火階段。
　　
　　3、溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈。這是延伸階段。
　　
　　如此重復(fù)，改變反應(yīng)溫度，即高溫變性，低溫退火，中溫延伸三個(gè)階段。這三次改變溫度為一個(gè)循環(huán)。每循環(huán)一次，使特異區(qū)段基因拷貝數(shù)擴(kuò)大一倍，一般30次循環(huán)，基因放大數(shù)可達(dá)2n倍?？捎霉?br />　　
　　Y＝（1＋X）n
　　
　　表示，式中Y＝DNA擴(kuò)增倍數(shù)，X＝擴(kuò)增效率，循環(huán)數(shù)為n。
　　
　　如X＝100%，n＝20時(shí)，Y＝1048576倍。但實(shí)際擴(kuò)增效率（X）不會(huì)達(dá)到100%。
　　
　　2試驗(yàn)條件
　　
　　本程序適用于自動(dòng)PCR操作，可適用于大多數(shù)情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶等。
　　
　　【藥品試劑】
　　
　　引物（各50pmol）
　　
　　0.2mmol/LdNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會(huì)發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等）
　　
　　模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質(zhì)粒DNA
　　
　　TaqDNA聚合酶（PerkinElmer,Norwalk,Connecticut）
　　
　　10×PCR緩沖液（500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris·HCl，pH8.3）
　　
　　礦物油
　　
　　電泳所需試劑