標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步(如圖所示)：

<img alt="PCR步驟" pcr步驟"="" border="1" height="199" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120504/1059292160-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120504/1059292160-0.jpg" width="141" style="vertical-align: middle; border: 0px;">

1.DNA變性(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，

氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火(復(fù)性)(40℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與

DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸(68℃-75℃)：在taq酶(在72℃左右*的活

性)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延

伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。

循環(huán)參數(shù)

1、預(yù)變性(Initial denaturation).

模板DNA*變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95℃加熱3-5分鐘。

2、引物退火(primer annealing)

退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)(經(jīng)驗(yàn))決定。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

3、引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶zui適溫度)。

延伸時間隨擴(kuò)增片段長短及所使用Taq酶的擴(kuò)增效率而定。

4、循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性：

變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。

5、循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6、zui后延伸

在zui后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。