DH 是一種普編存在的與代謝有關(guān)的酶。哺乳動物LDH 由兩個不同的亞基結(jié)合組成，以五種四聚體的同工酶存在。這些同工酶在催化、物理和免疫性能方面是不同的。亞基以”H”和”M”表示，形成H4，M4，H3M，H2M2和HM3。在心肌中”H”亞基占優(yōu)勢，心肌適合于丙酮酸的需氧的氧化。在骨胳肌和肝中”M”亞基占優(yōu)勢，它與厭氧代謝和丙酮酸還原有較大關(guān)系。

三、儀器、原料和試劑

儀器

絞肉機，冷凍離心機，透析袋，冰水浴，冰箱，紗布，濾紙等。

原料

為豬或牛心，從已宰動物身上取出，立即用冰保藏，運回后，馬上操作。

試劑

磷酸鈣凝膠(現(xiàn)配現(xiàn)用)：4kg 濾碎心肌抽提液所需凝膠量制備如下：1L0.44moL／L 磷酸氫二鈉在攪拌下，快速加入至1L0.66mol／L 氯化鈣?；旌衔锛訚獍彼?/span>(需25~28mL)以調(diào)pH 至8.2~8.6，并用大量水洗滌至洗滌的水不含氯離子(通常用20- 25L 洗5、6 次；前幾次用自來水)。凝膠懸浮于3L 水

中，冷至5℃。以下操作，包括離心，在5℃下進行。

四、操作步驟

1.酶的吸附與洗脫

整理好的肌肉在一細孔絞肉機中絞碎，再用少量水在組織搗碎器內(nèi)搗30秒。每批4kg 碎肉漿和10L水攪拌15~30分鐘。兩層紗布過濾，然后，重新用5L 水抽提。再次擠干后，合并紅色渾濁抽提液(容積約14.5L)并與磷酸鈣混膠混合。攪拌l0分鐘后，凝膠放置，使沉淀，倒去上清液后，離心(600×g，15分鐘)收集凝膠。用1.3L0．2moL/L 磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫酶。凝膠離心(600×g，15分鐘)取出，并用600mL 磷酸緩沖液攪拌1次。再離心以后棄去凝膠。

2.純化

合并洗脫液(容積約1.9L)用固體硫酸銨(42g/100mL 洗脫液)處理，所得沉淀離心(1400×g，1.5小時)。或者用0.40硫酸銨溶液加到125mL，沉淀用折疊濾紙過濾。約需6一12小時，在冰庫過濾，。

沉淀溶于200mL0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中，產(chǎn)生棕色溶液約325mL。不溶物離心除去。冷卻至0℃，加入0.6倍容積的冷(-15℃)丙酮，混合物放置l0℃10分鐘。離心(1400×g，30分鐘)，沉淀常常在兩層當中形成。小心傾去液體，沉淀和140mL0．21硫酸銨攪拌10分鐘。懸浮液離心(1400×g，30分鐘)，上清液(容積約140mL)用固體硫酸銨(13g/100mL)處理。離心(10000×g，15分鐘)，沉淀溶于水，得35~45mL 黃色溶液。冷至0℃并與0.6倍容積丙酮(-15℃)混和?；旌衔镌?/span>20℃放置10分鐘，離心(1400×g，1小時)；或10000×g，10分鐘。沉淀充分地分散在21％硫酸銨中，zui終容積為15~20mL，所得懸浮液對1L 0.2l 硫酸銨透析12小時。

3.結(jié)晶

透析袋內(nèi)溶液離心(10000×g，15分鐘)；得到幾乎無色的清溶液，用固體硫酸銨(40mg/mL)在離心杯內(nèi)處理，并立即離心(20000×g，0℃，3分鐘)。上清液可能稍渾，倒入另一個杯內(nèi)，10分鐘滴加室溫飽和硫酸銨直至加入量相當于0.1mL/0.1mL 酶液。置5℃，1或2小時，結(jié)晶離心(10000×g，20分鐘)收集。

4.重結(jié)晶

把結(jié)晶溶于zui小量的0℃水中，在5~10℃攪拌下，用20分鐘加固體硫酸銨(350mg/mL)。產(chǎn)量約20一30mg(3次重結(jié)晶品)。結(jié)晶可溶于7~21％硫酸銨或0.2mol/L 磷酸緩沖液(pH7.4)中，并保存于0℃。結(jié)晶形狀為細針狀。上述溶液放置6~8周不喪失活失。結(jié)晶酶較原肌肉抽提液活力提高90~130倍。