核酸原位雜交的基本原理 

核酸分子雜交是只具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫度和離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則退火（annealling）形成雙鏈的過程。這一雜交過程具有高度的特異性。 
雜交的雙方時待測核酸序列及探針。待測的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA核細(xì)胞總RNA。將核酸從細(xì)胞中分離純化后可以在體外與探針雜交（膜上印跡雜交），也可以直接在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行（原位雜交）。 
用于檢測的已知核酸片段稱之為探珍（probe）。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。 
由于DNA分子雙股螺旋在一定條件下可以解開（退火），而解開的雙螺旋經(jīng)重新配對后又能形成新的螺旋（復(fù)性），針對這一生物學(xué)特性，就可以用已知的核酸片段去檢測未知的核酸分子，并能確定其所在的部位，達(dá)到定位和定量的目的。例如，用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對組織、細(xì)胞進(jìn)行雜交，以便有無該病原體的感染。 
原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受統(tǒng)一組織中其他成分的影響，因此，對那些細(xì)胞數(shù)量少而散在分布于其他啊組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的研究更為方便。 
原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性，并可完整地保護(hù)組織和細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。 

核酸原位雜交的主要過程 

核酸原位雜交按檢測物的不同，分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。 
一．組織細(xì)胞的固定 
進(jìn)行核酸原位雜交的組織或細(xì)胞必須經(jīng)過固定處理。適宜核酸雜交的理想的固定液應(yīng)具備下列特點：1.能很好地保護(hù)組織細(xì)胞的形態(tài)。2.對核酸無抽提、修飾與降解作用。3.不改變核酸在細(xì)胞內(nèi)的定位。4.對核酸與探針的雜交過程*作用。5.對雜交信號無遮蔽作用。6.理化性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉。 
病理組織學(xué)常用的固定液均可用與核酸原位雜交是組織和細(xì)胞的固定，但各具優(yōu)缺點。一般而言，4%多聚加全市應(yīng)用的固定液之一，它能很好地保持組織或細(xì)胞內(nèi)的RNA，一般固定10-15分鐘RNA的含量比較恒定。10%的甲醛液雖然可促進(jìn)DNA雙鏈分子的交聯(lián)進(jìn)而變性，但用含50%的甲酰胺雜交液進(jìn)行雜交可解決。乙醇：冰醋酸（3：1）雖然廣泛用于核酸原位雜交時的組織細(xì)胞固定，不過固定后組織細(xì)胞內(nèi)RNA明顯減少，但同時本底也很低。由于固定的時間一是一個影響原位雜交的重要因素，因此還必須根據(jù)具體實驗摸索出適合自己要求的固定液與固定時間。 
二．預(yù)雜交 
核酸原位雜交時，由于組織細(xì)胞中的核酸都與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，以核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式存在與細(xì)胞漿或細(xì)胞核中，固定過程中固定液的交聯(lián)作用時胞漿或胞核內(nèi)的各種生物大分子形成網(wǎng)絡(luò)，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。因此，需進(jìn)行預(yù)雜交的過程，其目的是去除核酸表面的蛋白質(zhì)，屹立與核酸探針對靶核酸進(jìn)行雜交。常用去垢劑（detergeat）和/或蛋白酶對組織細(xì)胞進(jìn)行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白質(zhì)。常用的去垢劑由Triton-X100和十二烷基碘酸鈉（SDS），常用的蛋白酶有蛋白酶K等。蛋白酶K的純度、濃度、消化的時間在不同的組織細(xì)胞中相差極大，因此，必須進(jìn)行一系列的預(yù)試驗，找到適當(dāng)?shù)臐舛燃跋瘯r間。 
三、雜交 
雜交過程是核酸原位雜交技術(shù)的主要環(huán)節(jié)，包括以下重要內(nèi)容。 
1、探針的選擇 核酸原位雜交中所用的探針可以是雙鏈的DNA（dsDNA）也可以是單鏈的DNA（ssDNA）,或為RNA。近年來人工合成的寡核苷酸也得到了廣泛應(yīng)用。一般而言，標(biāo)記的DNA或RNA探針都可用于DNA或RNA的定位，其長度為50-300bp（堿基），這個長度范圍的探針在組織細(xì)胞中的穿透力好，雜交效率高。常用的探針有： 
（1）雙鏈DNA探針。常用于雜交的探針之一，可通過切口平移標(biāo)記或隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記。后者與前者相比，能產(chǎn)生高比活的探針，但標(biāo)記探針的產(chǎn)量較低，不適合大量切片的原位雜交。 
（2）人工合成脫氧寡核苷酸?？捎蒁NA合成儀合成，與克隆的DNA相比，人工合成脫氧寡核苷酸有下列優(yōu)點：特異性較高，當(dāng)DNA順序未知時可按氨基酸順序進(jìn)行合成，可用于相似基因順序差異研究；可用合成的不同順序探針對特定基因進(jìn)行*雜交條件的篩選；由于分子量小，與相同量的dsDNA探針相對而言，具有高得多的摩爾濃度。 
（3）單鏈cDNA探針。單鏈cDNA探針常通過克隆載體M13獲得。ssDNA探針與dsDNA探針相對比，其zui大優(yōu)點在于，ssDNA探針不會像dsDNA探針那樣與自身互補(bǔ)的第二條鏈復(fù)性雜交，增加了探針的有效濃度。 
（注：M13是大腸桿菌絲狀噬菌體系列中的一個。含有6400個左右的核苷酸單鏈閉環(huán)DNA分子。在用作克隆載體時，可以產(chǎn)生大量含有外源性DNA某一條鏈的DNA分子。）