*章 酵母擴(kuò)培
§1-1 實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)培
1培養(yǎng)基制備
【試劑】：冷麥汁、蒸餾水、新鮮雞蛋。
【器具】：試管(15×150)及(18×180)、小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)、卡氏罐、中速濾紙、電爐、量筒、不銹鋼鍋、糖度計(jì)等。
【儀器】：殺菌鍋、天平(精度0.1g)。
【方法】
〖試管、三角瓶及巴氏瓶培養(yǎng)基的制備〗
① 取樣：取糖化冷卻麥汁，視麥汁濁度情況判定是否進(jìn)行過(guò)濾。
2℃，按每0.5~1L使用一個(gè)雞蛋的比例，加入打成泡沫的蛋清，在不斷地?cái)嚢柘卤?0min;然后升溫煮沸30min;將煮沸后的麥汁用水浴冷至80~90℃，用雙層中速濾紙過(guò)濾。±② 澄清：將麥汁加熱至45
0.2°P。±③ 調(diào)糖：將過(guò)濾后的麥汁用蒸餾水調(diào)整糖度為11
④ 分裝：試管(15×150)5mL，試管(18×180)10mL，分裝小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)。
⑤ 滅菌：分裝后包扎好，115℃殺菌20min;殺菌后培養(yǎng)基放置2~3天，確定無(wú)菌后備用。
〖卡氏罐培養(yǎng)基的制備〗
取糖化冷卻麥汁(有條件的可取薄板前熱麥汁)加入卡氏罐，然后封閉卡氏罐取樣口，各呼吸閥等接口處均應(yīng)以棉塞或呼吸閥進(jìn)行封閉后包扎結(jié)實(shí)，115℃殺菌30~40min，于室溫冷卻至17~18℃;接種前以3L/min的速率充純氧2~3min(卡氏罐有效容積20L)。
2接種操作
【器具】：酒精燈、酒精棉、剪刀、接種針、鑷子、定量移液器或吸管等。
【儀器】：超凈工作臺(tái)等。
【方法】
無(wú)菌室使用前，使用紫外線燈照射20~30分鐘進(jìn)行殺菌;進(jìn)入無(wú)菌室換無(wú)菌工作服;所有操作采用無(wú)菌操作。
〖活化〗
① 操作前將冷凍管菌種置于室溫下，使之內(nèi)部培養(yǎng)基達(dá)到室溫后，振蕩均勻;無(wú)菌操作，將冷凍管內(nèi)的培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)入盛有5mL培養(yǎng)基的試管中，于25±1℃培養(yǎng)72±2小時(shí)。
② 將試管中的培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻，用接種環(huán)接取三環(huán)加入另一支盛有5mL培養(yǎng)基的試管中，于25±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí)。
③ 將培養(yǎng)結(jié)束的試管培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻，用無(wú)菌吸管接0.1mL加入盛有10mL培養(yǎng)基的試管，振蕩均勻后于25±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí)。
〖擴(kuò)大〗
① 將培養(yǎng)結(jié)束的試管培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻后，全部接入小巴氏瓶(三角瓶)，每個(gè)小巴氏瓶(三角瓶)接入一支試管的培養(yǎng)液;然后于23±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí)。
② 將培養(yǎng)結(jié)束的小巴氏瓶(三角瓶)輕輕振蕩均勻后，全部接入大巴氏瓶(大三角瓶)，每個(gè)大巴氏瓶(大三角瓶)接入一只小巴氏瓶(三角瓶)的培養(yǎng)液;然后于21±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí)。
③ 將培養(yǎng)結(jié)束的大巴氏瓶(大三角瓶)輕輕振蕩均勻后，全部接入卡氏罐，每個(gè)卡氏罐接入兩只大巴氏瓶(大三角瓶)的培養(yǎng)液;然后于18±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí)。
〖注〗：除卡氏罐外，其它液體培養(yǎng)基在接種后每12小時(shí)應(yīng)振搖一次，以去除二氧化碳，保證酵母耗氧需求。
【實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)培工藝】
容 器 擴(kuò)大倍數(shù) 培養(yǎng)溫度℃ 培養(yǎng)時(shí)間hr
冷凍管→液體試管 活化 25±1 72±2
液體試管 活化 25±1 24~36
液體大試管 活化 25±1 24~36
小巴氏瓶(三角瓶) 10 23±1 24~36
大巴氏瓶(大三角瓶) 10 21±1 24~36
卡氏罐 10 18±1 24~36
注：1.試管至三角瓶階段，至少多做1-2個(gè)(支)備用，防止出現(xiàn)意外情況，影響擴(kuò)培。
2.卡氏罐接種前充純氧，充氧速率3L/min， 2-3min。
§1-2 生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)培
1準(zhǔn)備工作
【設(shè)備準(zhǔn)備】：每次擴(kuò)培前應(yīng)將待使用的自糖化至漢生罐、擴(kuò)大罐的管路及漢生罐、擴(kuò)大罐、連接管路、空氣濾器進(jìn)行刷洗和滅菌。
【培養(yǎng)基滅菌】：取糖化冷卻麥汁(有條件的可取薄板前熱麥汁)加入漢生罐或擴(kuò)大罐，進(jìn)行升溫殺菌。通常在常壓下保持沸騰30~40min即可。殺菌后用無(wú)菌空氣備壓0.05MPa后降溫至14±0.5℃?zhèn)溆谩?br />2漢生罐接種操作
【接種】：將殺菌麥汁接入漢生罐后，再將已擴(kuò)培好的卡氏罐菌種接種至漢生罐，擴(kuò)培比例為1:10~15。
【通風(fēng)】：保證酵母生長(zhǎng)對(duì)氧的需求，具體通風(fēng)量根據(jù)酵母生長(zhǎng)情況調(diào)整，若酵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較多或細(xì)胞拉長(zhǎng)現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)增減通風(fēng)量。
【溫度】：接種前控溫在14±0.5℃，接種后培養(yǎng)液自然升溫至16℃，并保持16±0.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。
【備壓】：接種前備壓0.05MPa，接種后保持罐內(nèi)正壓。
【培養(yǎng)時(shí)間】：接種后培養(yǎng)36~48hr，待細(xì)胞濃度達(dá)到35~40×106個(gè)/mL方可轉(zhuǎn)罐。
【檢測(cè)】接種前的無(wú)菌麥汁及接種后的培養(yǎng)液，應(yīng)作微生物檢測(cè)。
3擴(kuò)大罐擴(kuò)培
【接種】：擴(kuò)大罐內(nèi)接入冷麥汁(殺菌或不殺菌，保證麥汁無(wú)菌)，將漢生罐內(nèi)的培養(yǎng)液充分?jǐn)嚢韬?，全部壓入擴(kuò)大罐(擴(kuò)大比例1:5~6)。
【通風(fēng)】：具體通風(fēng)量根據(jù)酵母生長(zhǎng)情況調(diào)整，若酵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較多或細(xì)胞拉長(zhǎng)現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)增減通風(fēng)量。酵母起發(fā)后，應(yīng)將流量和通風(fēng)時(shí)間適當(dāng)減少。
【溫度】：麥汁溫度為12±0.5℃，自然升溫至14℃，并于14±0.5℃控溫培養(yǎng)。
【備壓】：接種前備壓0.05MPa，接種后保持罐內(nèi)正壓。
【培養(yǎng)時(shí)間】：培養(yǎng)24~36hr，待酵母數(shù)達(dá)到35~40×106個(gè)/mL以上時(shí)，即可進(jìn)行下一步擴(kuò)培。
4二次(車間)擴(kuò)大罐擴(kuò)培
將擴(kuò)大罐的培養(yǎng)液充分?jǐn)嚢韬螅繅喝攵?車間)擴(kuò)大罐(擴(kuò)大比例1:3~4)。再向二次(車間)擴(kuò)大罐進(jìn)充氧冷麥汁或?qū)ε囵B(yǎng)液進(jìn)行適度通風(fēng)(麥汁含氧量8mg/L以上)，料溫控制11±0.5℃，接種后自然升溫至12℃，并于11~12℃保溫培養(yǎng);壓力維持罐內(nèi)正壓;培養(yǎng)24±2hr，待酵母數(shù)達(dá)到35~40×106個(gè)/mL以上時(shí)，即可進(jìn)行追加麥汁或移入發(fā)酵罐進(jìn)行繁殖。
【車間擴(kuò)大培養(yǎng)工藝】
容 器 擴(kuò)大倍數(shù) 培養(yǎng)溫度℃ 培養(yǎng)時(shí)間hr 充氧狀況
卡氏罐→漢生罐 10~15 16±1 36~48 根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)節(jié)
擴(kuò)大罐 5~6 14±1 24~36 根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)節(jié)
二級(jí)擴(kuò)大罐 3~4 12±1 24±2 充氧麥汁
浮選罐或發(fā)酵罐 1~2 10±1 24±2 充氧麥汁
發(fā)酵罐追加滿罐 約1 工藝控溫 24±2 充氧麥汁
第二章 菌種保藏
1實(shí)驗(yàn)室菌種保藏與活化
【形式】：保種形式分為冷凍保種管和固體斜面保藏兩種。
〖冷凍保種管〗：青啤酵母以冷凍保種管的形式提供，-20~-25℃保藏，一次擴(kuò)培使用一支。
〖固體斜面〗
① 保藏：其它酵母菌種以固體斜面形式0~4℃冷藏保藏，定期活化;
② 活化：每三個(gè)月活化一次。接一環(huán)斜面菌種于5mL麥汁液體培養(yǎng)基中，于25±1℃培養(yǎng)24~36小時(shí);待酵母起發(fā)后，將培養(yǎng)液振蕩均勻，用接種環(huán)涂劃固體斜面，于25±1℃培養(yǎng)60~72小時(shí);然后于0~4℃冷藏保藏。
③固體斜面菌種每年更換一次。
2漢生罐菌種保藏與活化
【保種操作】
① 可將正在擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)液由擴(kuò)培罐壓回至漢生罐，或直接將漢生罐的菌種留約1/5擴(kuò)培液追加殺菌麥汁進(jìn)行保種。
② 培養(yǎng)48~72小時(shí)后，至糖度降至7~8°P時(shí)，迅速將溫度降至2~4℃進(jìn)行保種，壓力為0.05MPa。每月更換一次麥汁進(jìn)行活化，漢生罐菌種使用及活化次數(shù)總共不超過(guò)8次。
【活化操作】
① 將擴(kuò)培罐麥汁殺菌降溫至12~13℃?zhèn)溆谩?br />② 將漢生罐內(nèi)培養(yǎng)液通風(fēng)攪拌后，全部轉(zhuǎn)移至擴(kuò)大罐中(擴(kuò)大比1:5~6)，于14±0.5℃進(jìn)行培養(yǎng)，保持罐內(nèi)正壓，通風(fēng)同擴(kuò)培。
③ 待酵母數(shù)達(dá)到30×106個(gè)/mL以上時(shí)，將待留種的培養(yǎng)液打回漢生罐，按【保種操作】②條操作。剩余擴(kuò)培液可打入發(fā)酵罐。
第三章 酵母檢測(cè)
§3-1 取 樣
1擴(kuò)培液、發(fā)酵液及待濾酒等的取樣
【器具】取樣瓶、便攜式噴燈、酒精噴霧器或酒精棉、打火機(jī);
【方法】
① 將取樣閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，用便攜式噴燈或點(diǎn)燃酒精棉灼燒取樣口(灼燒適度，避免損傷內(nèi)部膠墊)，進(jìn)行清潔和滅菌;
② 然后打開取樣閥，放出約1000mL液體，關(guān)閉取樣閥;
③ 再次用酒精棉擦拭后，先打開取樣閥，調(diào)整合適的流速，防止液體在取樣時(shí)迸濺，用取樣瓶接取樣品約300mL，封閉取樣瓶口;
④ 關(guān)閉取樣閥，用酒精噴霧器噴灑酒精或用酒精棉擦拭，對(duì)其進(jìn)行清潔和滅菌。
2酵母泥的取樣
【器具】取樣瓶、便攜式噴燈、酒精噴霧器或酒精棉、打火機(jī);
【方法】
A回收罐的取樣
① 將取樣閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，進(jìn)行清潔和滅菌;
② 然后打開取樣閥，放出約1000mL酵母泥，關(guān)閉取樣閥;
③ 先打開取樣閥，調(diào)整合適的流速，防止酵母泥在取樣時(shí)迸濺，用取樣瓶接取樣品約200mL后，封閉取樣瓶口;
④ 關(guān)閉取樣閥，用酒精噴霧器噴灑酒精或用酒精棉擦拭，對(duì)其進(jìn)行清潔和滅菌。
B錐形罐的取樣
① 將錐底閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，進(jìn)行清潔和滅菌;
② 然后打開錐底閥，放出底部摻有凝固物的酵母泥，至流出潔白的酵母泥時(shí)關(guān)閉錐底閥;
③ 再次用酒精棉擦拭后，先打開錐底閥，調(diào)整合適的流速，防止酵母泥在取樣時(shí)迸濺，用取樣瓶接取樣品約200mL后，封閉取樣瓶口;
④ 關(guān)閉錐底閥，用清水將閥內(nèi)沖洗干凈。
§3-2 檢 測(cè)
1酵母細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)
【適用】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等
【原理】在酵母菌的各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，利用顯微鏡對(duì)酵母細(xì)胞的外形及內(nèi)容物等進(jìn)行觀察。
【器具】顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí);
② 取一滴樣品或少量菌體于載玻片上，加數(shù)滴蒸餾水，用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于樣品上面，注意不要產(chǎn)生氣泡，用顯微鏡進(jìn)行檢查;
③ 先使用顯微鏡低倍物鏡(×10)，調(diào)整載玻片位置，對(duì)準(zhǔn)樣品視野后換用高倍物鏡(×40)觀察;
④ 優(yōu)良的酵母菌種呈圓形或卵圓形，細(xì)胞較飽滿，細(xì)胞膜較薄，胞內(nèi)液泡較小，形態(tài)整齊一致;無(wú)異狀(拉長(zhǎng))細(xì)胞。若觀察擴(kuò)培液，則出芽率較高，酵母大小的一致性稍差。
2酵母細(xì)胞大小測(cè)定
【適用】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等
【原理】采用已用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正過(guò)的目鏡測(cè)微尺和顯微鏡測(cè)定單細(xì)胞的大小。
【器具】顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、載玻片、蓋玻片等。
【方法】
① 將目鏡測(cè)微尺裝入目鏡內(nèi)，刻度朝下，并將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上;
② 用低倍鏡觀察到鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度;
③ 換用高倍鏡測(cè)量，先用鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)定，計(jì)算出目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度。移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺和轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺，使二者的刻度平行，并使兩尺的*條線重合，向右尋找另外相重合的直線，記錄兩重合刻度間目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)，由下列公式計(jì)算目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度;由于鏡臺(tái)測(cè)微尺每格長(zhǎng)度為10μm，從鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)，求目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度(μm)。
兩重合刻度間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)×10
目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度(μm) =
兩重合刻度間目鏡測(cè)微尺格數(shù)
④ 取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母制片，在高倍鏡下測(cè)量10~20個(gè)酵母細(xì)胞的直徑。
3酵母泥外觀檢測(cè)
【適用】酵母泥
【原理】應(yīng)用目測(cè)方法對(duì)酵母泥的外觀進(jìn)行判斷。
【器具】取樣瓶、燈光。
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí)。
② 將樣品置于光線充足處，用肉眼觀察?，F(xiàn)場(chǎng)使用的酵母泥應(yīng)有新鮮的光澤，呈乳白色;用手捻開時(shí)松散且不粘連。若色澤灰暗、發(fā)粘、有臭酵母味，則說(shuō)明酵母泥的質(zhì)量較差。
4酵母細(xì)胞數(shù)和出芽率的測(cè)定(血球計(jì)數(shù)板法)
A A
A
A A
【適用】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、待濾酒等
【原理】如圖所示，血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室分25個(gè)中格，每個(gè)中格又分16個(gè)小格，所以計(jì)數(shù)室內(nèi)共有25×16 = 400個(gè)小格;計(jì)數(shù)室的容積為1mm(長(zhǎng))×1mm(寬)×0.1mm(高)= 0.1 mm3 = 1×10-4mL;通常計(jì)數(shù)5個(gè)“A” 區(qū)的酵母細(xì)胞總數(shù)。
【器具】顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片等;
【試劑】1M H2SO4固定液
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)用1MH2SO4固定液對(duì)樣品進(jìn)行固定;樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測(cè)定結(jié)果反映樣品本質(zhì)。
② 取50mL容量瓶加入蒸餾水約30mL和1M的H2SO4固定液約2mL，再加入樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋定容，使計(jì)數(shù)時(shí)計(jì)數(shù)板內(nèi)中格內(nèi)細(xì)胞數(shù)在30個(gè)左右。
③ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計(jì)數(shù)板上面;將稀釋好的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過(guò)多)，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。
④ 靜置1~2min，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)。
⑤ 計(jì)數(shù)5個(gè)中格“A”中的細(xì)胞總數(shù)(包括出芽的細(xì)胞)和出芽細(xì)胞數(shù)。
【計(jì)算】
酵母細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)= B×104
其中 A——5個(gè)中格的酵母細(xì)胞總數(shù);
B——稀釋倍數(shù)。
出芽率(%)= 5個(gè)中格的出芽細(xì)胞數(shù)/5個(gè)中格的細(xì)胞總數(shù)×100
【注意】*計(jì)酵母數(shù)時(shí)，位于格線上的酵母菌，一般只計(jì)此格的上方及右方線上的菌體;
*測(cè)定酵母菌出芽率時(shí)，當(dāng)芽細(xì)胞大于或等于母細(xì)胞的1/2時(shí)計(jì)為兩個(gè)細(xì)胞，不作出芽計(jì);當(dāng)芽細(xì)胞小于母細(xì)胞的1/2時(shí)，該細(xì)胞計(jì)為一個(gè)出芽細(xì)胞。
5酵母死亡率的測(cè)定(血球計(jì)數(shù)板法)
【適用】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等
【原理】酵母細(xì)胞具有還原次甲基紫的一種還原酶。當(dāng)酵母細(xì)胞浸于次甲基紫溶液時(shí)，色素滲入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的還原酶將其還原脫色;死細(xì)胞的還原酶失活，不能將其脫色，細(xì)胞被染成紅色。
【器具】顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片等
【試劑】次甲基紫染色液[C =0.01%(W/V)]：將0.01g次甲基紫溶于2%(W/V)二水檸檬酸鈉溶液，定容至100mL。
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí);樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測(cè)定結(jié)果反映樣品本質(zhì);
② 先把待測(cè)的酵母菌(液)用蒸餾水稀釋至每中格中含有大約40~70個(gè)左右酵母菌;
③ 取1mL預(yù)先稀釋好的酵母菌懸液加入試管，再加入1mL次甲基紫染色液，搖勻后染色4~5min;
④ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計(jì)數(shù)板上面;將染色的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過(guò)多)，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡;
⑤ 將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下觀察，死細(xì)胞被染成紅色;
⑥ 計(jì)數(shù)5個(gè)中格“A”中(見4之圖示)的細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。
【計(jì)算】
酵母死亡率(%)= (染色酵母數(shù)/酵母總數(shù))×100%
6酵母肝糖染色法
【樣本】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等
【原理】肝糖是酵母細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)，通過(guò)肝糖檢測(cè)可判別酵母的營(yíng)養(yǎng)狀況;碘化鉀可將肝糖染成紅褐色，從而使含有肝糖的酵母細(xì)胞內(nèi)部顆粒呈現(xiàn)紅褐色。
【器具】顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片等;
【試劑】碘液：稱取1g碘和3g碘化鉀于研缽中充分研磨均勻，然后在不斷攪拌下加入50mL水進(jìn)行溶解，稀釋至60mL，于棕色瓶中保存使用，有效期一個(gè)月。
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí);樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測(cè)定結(jié)果反映樣品本質(zhì);
② 先把待測(cè)的酵母菌(液)用蒸餾水稀釋至每中格中含有大約40~70個(gè)左右酵母菌;
③ 取1mL預(yù)先稀釋好的酵母菌懸液加入試管，再加入1mL碘液，搖勻后染色4~5min;
④ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計(jì)數(shù)板上面;將染色的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過(guò)多)，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。
⑤ 將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞菌體呈黃色，肝糖顆粒被染成紅褐色;
⑥ 計(jì)數(shù)5個(gè)中格“A”中(見4之圖示)的細(xì)胞總數(shù)和含有染色顆粒的細(xì)胞數(shù)。
【計(jì)算】
酵母肝糖染色率(%)= (含有染色顆粒的酵母數(shù)/酵母總數(shù))×100%
7酵母凝聚性的測(cè)定
【適用】酵母泥等
【原理】應(yīng)用硫酸鈣促凝作用，在酵母沉降一定時(shí)間時(shí)，利用光密度的方法對(duì)其沉降程度進(jìn)行評(píng)估。
【器具】離心機(jī)(配50mL塑料離心管)、電子臺(tái)秤(0.01g)、分光光度計(jì)、比色管(25mL和50mL)、定量吸管(3mL);
【試劑】
① 醋酸緩沖液：將0.51g硫酸鈣、6.80g醋酸鈉和4.05g冰醋酸溶于水中，定容至1000mL;
② EDTA溶液[C(EDTA)=0.01M]：將3.73g EDTA溶于水中，定容至1000mL;
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí);
② 離心：將酵母泥樣品振蕩均勻，加入50mL離心管內(nèi)約40mL，于4000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液;
③ 洗滌：稱取離心酵母泥1.00g于離心管中，加入0.01M的EDTA溶液20mL充分振勻后，于4000rpm離心10min，棄上清液;再次加入相同數(shù)量的EDTA溶液充分振勻，進(jìn)行洗滌后離心，棄上清液，備用;
④ 轉(zhuǎn)移：在上述酵母泥沉淀中加入醋酸鈉緩沖溶液，并將酵母泥洗滌至50mL比色管中，用醋酸鈉緩沖溶液定容至50mL;轉(zhuǎn)移應(yīng)盡快完成。
⑤ 靜置：將移入酵母泥懸液的50mL比色管迅速放入20℃恒溫水浴中保溫30min;
⑥ 比色：用定量吸管迅速吸取保溫后的50mL比色管的zui上端的3mL液體，并于比色杯內(nèi)混勻后，于670nm以醋酸鈉緩沖液為空白測(cè)得吸光度B;
⑦ 原始濁度：稱取離心酵母泥0.50g于離心管中，加入0.01M的EDTA溶液10mL充分振勻后，于4000rpm離心10min，棄上清液;再次加入相同數(shù)量的EDTA溶液充分振勻，進(jìn)行洗滌后離心，棄上清液;用蒸餾水洗滌至25mL比色管中并定容，充分振蕩均勻后于670nm以蒸餾水為空白測(cè)得吸光度A;
【計(jì)算】
酵母凝聚性(%)= [(A - B)/A]×100%
8酵母死滅溫度的測(cè)定
【適用】回收酵母、實(shí)驗(yàn)室菌種等
【原理】培養(yǎng)基中一定量的菌體在不同的溫度下保溫一定的時(shí)間，其保溫后不能生長(zhǎng)的溫度即為其死滅溫度。
【器具】恒溫水浴
【試劑】11°P麥汁液體培養(yǎng)基
【方法】
① 分離：酵母泥取回后應(yīng)立即進(jìn)行劃線分離，選取所需試驗(yàn)的菌落進(jìn)行試驗(yàn)。
② 活化：將需要試驗(yàn)的純酵母菌種(分離后或原始菌種)接一接種環(huán)于5mL麥汁液體培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)36±2小時(shí)活化;
③ 富集：將活化后培養(yǎng)液振蕩均勻后，將其接種三環(huán)于5mL麥汁培養(yǎng)基;每一試驗(yàn)菌種共接8支試管培養(yǎng)基。然后于25℃培養(yǎng)4±0.5小時(shí)進(jìn)行富集;
④ 保溫：將恒溫水浴調(diào)節(jié)溫度至48±0.5℃，將培養(yǎng)后的待測(cè)菌培養(yǎng)液振蕩均勻，每只待測(cè)菌取兩支試管，與一插有溫度計(jì)的的麥汁培養(yǎng)基試管一起放入水浴;待麥汁試管的溫度計(jì)的溫度達(dá)到48℃時(shí)，開始計(jì)時(shí)保溫10min;保溫終止立即將試驗(yàn)試管移入冰水降溫至室溫。同樣步驟進(jìn)行50℃、52℃、54℃的保溫試驗(yàn);
⑤ 培養(yǎng)：將保溫后的培養(yǎng)液置于25℃培養(yǎng)5~7天，每天觀察試管中有無(wú)菌體生長(zhǎng)并記錄;
⑥ 結(jié)論：酵母不能生長(zhǎng)的zui低溫度即為其死滅溫度。
9酵母發(fā)酵失重實(shí)驗(yàn)
【適用】回收酵母等
【原理】在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用低接種量，模擬生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)酵，通過(guò)稱重方法推算其起發(fā)速度，從而評(píng)判酵母的性能。
【器具】離心機(jī)(配50mL塑料離心管)、電子臺(tái)秤(0.01g)
【試劑】11°P麥汁液體培養(yǎng)基
【方法】
① 樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí)。
② 離心：將待試酵母泥樣品充分振蕩均勻，取約40mL加入離心管，于4000rpm離心10min，棄上清液;
③ 接種：將盛有200mL麥汁培養(yǎng)基的三角瓶置于電子臺(tái)秤上調(diào)零，用無(wú)菌玻璃棒粘取離心后的酵母泥，接種于三角瓶0.4g(相當(dāng)于接種比例2‰);
④ 稱重：然后取下三角瓶，將電子臺(tái)秤調(diào)零;對(duì)接種后的三角瓶(含塞子)進(jìn)行全部稱重，并記錄數(shù)據(jù)作為原重;將稱重后的三角瓶置于12℃環(huán)境培養(yǎng)，每隔24小時(shí)對(duì)其進(jìn)行稱重并記錄;共稱重10天;
⑤ 發(fā)酵度：發(fā)酵10天后的發(fā)酵液過(guò)濾，測(cè)定其發(fā)酵度;
⑥ 分析：根據(jù)每天的減重情況及zui后的發(fā)酵度測(cè)定可分析酵母的起發(fā)、高泡期的糖酵解速度和程度。
10酵母的呼吸缺陷型檢測(cè)
【適用】擴(kuò)培液、發(fā)酵液、酵母泥等
【原理】酵母的呼吸缺陷型突變菌體，主要是由于細(xì)胞的線粒體中缺少細(xì)胞色素a、a1、a3和b，因而喪失了呼吸能力。當(dāng)2,3,5—三苯基四氮唑鹽酸鹽(TTC)染料和酵母菌落在一起時(shí)，呼吸*型酵母會(huì)將無(wú)色的TTC還原成紅色，而呼吸缺陷型則無(wú)此能力，菌落仍保持原來(lái)的白色。
【器具】殺菌鍋、天平、無(wú)菌室、接種針、涂布棒等
【試劑】
① TTC培養(yǎng)基：將TTC(2,3,5-triphenyl tetrazolium chlorde)0.5g、葡萄糖5g和瓊脂20g，加熱溶解后稀釋至1000mL， 于115℃滅菌20min，冷卻備用;
② YEPD培養(yǎng)基：將酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g和瓊脂20g加熱溶解后稀釋至1000mL，于115℃滅菌20min，冷卻備用;使用前加熱溶解，傾倒平板;該培養(yǎng)基可用麥汁瓊脂培養(yǎng)基替代。
【方法】
① 樣品處理：樣品取回后，應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè);若不能立即檢測(cè)，應(yīng)置于冰箱保存，保存時(shí)間為0~6℃不超過(guò)2小時(shí)。
② 菌落的形成
a.將待檢測(cè)酵母用接種環(huán)挑取一小環(huán)，接入10mL無(wú)菌水，混勻，然后稀釋成不同濃度梯度的稀釋液，稀釋比例為10-4~10-6;
b.取稀釋液0.2mL接入YEPD培養(yǎng)基或麥汁固體培養(yǎng)基平板，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布，每個(gè)稀釋度涂布平板2個(gè)，取2個(gè)平板的菌落數(shù)在50~150個(gè)為計(jì)數(shù)平板;
c.將平板倒置于25℃好氧培養(yǎng)2~3天。
③TTC培養(yǎng)基覆蓋
a.將TTC培養(yǎng)基溶解后冷卻至45℃左右，立即倒入已形成菌落的平板，覆蓋住所有菌落;
b.待培養(yǎng)基凝固后置于25℃培養(yǎng)1~3小時(shí)。
④呼吸缺陷型判定
觀察平板上菌落的顏色。正常菌落為粉紅或紅色;呼吸缺陷型菌落的顏色為白色。
【計(jì)算】
呼吸缺陷型百分率(%)=2個(gè)平板白色菌落數(shù)/2個(gè)平板的總菌落數(shù)×100%
酵母菌主要的代表屬有啤酒酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬等酵母菌培養(yǎng)主要是食品領(lǐng)域等。