zui長聽說的是Oligo(dT)，主要是由T(胸腺嘧啶）構(gòu)成的核苷酸鏈，其次Oligo引物設(shè)計軟件，由于其操作的簡便性和引物分析設(shè)計的功能強大而風(fēng)靡,Oligo芯片是微陣列的一種，又稱寡核苷酸微陣列。

oligo(dT)

定義

多聚胸腺嘧啶、T重復(fù)寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈。

應(yīng)用

1.oligo(dT) capture

因為Oligo(dT)與mRNA的Poly(A)尾巴可以發(fā)生特異性結(jié)合，所以用Oligo(dT)特異結(jié)合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特異地將mRNA從總RNA中分離出來。屬于親和層析技術(shù)。

2.反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)

因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)與其配對，僅mRNA可被反轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A) RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物所得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。但是在反轉(zhuǎn)錄從mRNA獲得cDNA時，也可以用隨機六聚體引物和特異性引物。

隨機六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA*鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

特異性引物：zui特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，*條鏈的合成可由與mRNA 3’端zui靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。

Oligo 6.22 使用技巧簡介

1.功能

在專門的引物設(shè)計軟件中，“Oligo”是zui的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個圖：Tm 圖和ΔG 圖;Oligo .22 的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個圖，加了個Frq 圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計。但它的引物分析功能如此強大以至于能。

2.使用(以O(shè)ligo 6.22 為例)

Oligo 6.22 的啟動界面如下：

圖中顯示的三個指標(biāo)分別為Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個堿基組成的亞單位在一個數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)6的可能性。因為分析要涉及多個指標(biāo)，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。

經(jīng)過Windows/Tili 項后的顯示如圖：

在設(shè)計時，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm 圖塊上左 下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選 取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。?G 值反映了序列與模板的結(jié)合強度，引物的?G 值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低(如圖：)

Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq 曲線 為“Oligo 6”新引進的一個指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用3’端Frq 值相對較低的片段。

當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價并根據(jù)評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成(cross dimer)。二聚體形成的能值 越高，越不符合要求。一般的檢測(非克隆)性PCR，對引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin);與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5 為好。 當(dāng)然，在設(shè)計克隆目的的PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 而且能值不會太低。這種PCR 需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達到效果，對引物的發(fā)夾 結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。第三項檢查為GC 含量，以45-55%為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基 因組DNA，而是一個特定模板序列，那么還進行False priming site 的檢測。這項檢查可以看出引物在非目的位點引發(fā)PCR 反應(yīng)的可能性。如果引物在錯配位點的引發(fā)效率比較 高，就可能出假陽性的PCR 結(jié)果。一般在錯配引發(fā)效率以不超過100 為好，但對于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的 引發(fā)效率為450 以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為130，那么這對引物也是可以接受的。

當(dāng)我們結(jié)束以上四項檢測，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm 值等參數(shù)，zui有用的是還給出了推薦的*退火溫度和簡單的評價。

由于“Oligo”軟件的引物自動搜索功能與“Primer Premier 5”的相類似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟件自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找*引物，如果參數(shù)設(shè)置得當(dāng)將大大提高工作效率。

Oligo芯片

Oligo芯片是在cDNA芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。他通過預(yù)先設(shè)計并合成特性的寡核苷酸一般25-60mer長度，然后將其點樣到特定的基質(zhì)上構(gòu)成芯片。他克服了由于探針雜交條件變化巨大導(dǎo)致的數(shù)據(jù)結(jié)果的不可靠。但也存在點樣時引物濃度不同引起的信號差異變化。由于Oligo芯片的探針是初期一次性合成，因此Oligo芯片需要合成的數(shù)量十分巨大才能使每片的成本攤薄。事實上，由于每次芯片的使用很少，加上實驗分析等消耗的時間，從實驗初期到實驗?zāi)┢诘臅r間跨度很大，因此早期合成的Oligo探針存在著降解而導(dǎo)致檢測質(zhì)量下降的情況，這樣，除非重新合成新的探針，否則后期的芯片的檢測質(zhì)量會大大的降低。同時，如果實驗?zāi)繕?biāo)發(fā)生變動，則合成的探針無法繼續(xù)使用，造成巨大的浪費。

推薦：oligo6.0是現(xiàn)在使用zui廣泛的引物和探針設(shè)計軟件，值得一提的是它具有多重PCR引物設(shè)計和LCR反應(yīng)探針設(shè)計的功能。