摘要：微囊泡（MVs）通過轉移細胞的脂質和蛋白成分到靶細胞作為細胞之間通訊的新機制出現(xiàn)，但其在疾病中的功能才剛剛開始被研究。我們發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞來源的MVs在類風濕性關節(jié)炎患者關節(jié)液中的濃度與血漿濃度相比有所升高。關節(jié)液MVs過表達消炎、抗炎蛋白膜聯(lián)蛋白A1（AnxA1）。TMEM16F是一種脂質爬行酶，在微囊泡形成過程中發(fā)揮作用。而TMEM16F缺陷小鼠當經受炎性關節(jié)炎時軟骨損傷可加重。為了明確MVs在類風濕性關節(jié)炎中的作用，探索以MVs為基礎的治療策略的可能性，我們在嚙齒類動物模型和人類原代軟骨細胞中檢測了免疫細胞來源的MVs的作用。在體外實驗中，外源性中性粒細胞來源的AnxA1陽性的MVs激活軟骨細胞合成代謝基因的表達，通過減少壓力適應的自我調節(jié)因子IL-8和前摘要：微囊泡（MVs）通過轉移細胞的脂質和蛋白成分到靶細胞作為細胞之間通訊的新機制出現(xiàn)，但其在疾病中的功能才剛剛開始被研究。在活體實驗中，關節(jié)內注射AnxA1(+)MV可減少類風濕性關節(jié)炎引起的軟骨退化。接受過繼轉移的中性粒細胞的關節(jié)炎小鼠的軟骨基質中顯示出大量的MVs，表明是MVs而非中性粒細胞自身穿透軟骨。通過MVs相關的AnxA1與其受體FPR2/ALX互作模型的機制研究顯示兩者相互作用，從而使軟骨細胞TGF-β產生增加，zui終引起軟骨的保護。我們猜想，MVs可以作為一個*的治療策略，要么通過直接或者裝藥的形式用于保護與軟骨退化相關的疾病。

圖1：人類類風濕關節(jié)炎（RA）滑膜液中含有豐富的ANXA1陽性嗜中性粒細胞MV來保護軟骨。

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圖1 A、B在RA患者血液和關節(jié)滑液中MV（A圖）和ANXA1陽性MV（B圖）CD66b（中性粒細胞來源）、CD14（單核細胞來源）、CD3（T細胞來源）的表達水平。

圖1 C、D用更多的例數(shù)驗證CD66b（中性粒細胞來源）的MV比另外兩種更多。

圖1 F 比較野生型和TMEM16F缺陷小鼠的膝蓋、踝關節(jié)、足趾樣本，缺陷小鼠的關節(jié)損傷更為嚴重。

圖2：源自健康中性粒細胞的AnxA1-richMVs的生成與特征。

圖2A、B、C 分別用TNF-a (50 ng/ml) 和vehicle (Control)刺激嗜中性粒細胞；超過75％的MV是CD66b+和結合的膜聯(lián)蛋白V，而大約60％的MV是陽性鬼筆環(huán)肽；MV還表達髓系相關蛋白8（MRP8）以及其結合配體MRP14。

圖2D、E、F：通過流式細胞術（D、E）和Westernblotting（F）檢測AnxA1的表達，TNF刺激過的MV陽性率更高；然而經TNF刺激過的每個MV總蛋白含量并無變化。

圖2 H：納米粒子追蹤分析（NTA）提供的測量合并的MV（TNF）樣品，其中90％的囊泡直徑<412毫微米，zui高頻率是143毫微米。

圖2 J：用TNF-a， interleukin-8 (IL-8)和佛波醇脂(PMA)處理后的MV量。K：獲得的MV在120分鐘達到，在稍后的兩個時間點觀察到中性粒細胞外陷(NET)。

圖3：中性粒細胞的MV引起細胞外基質積聚，而且是體外保護軟骨細胞的微團。

圖3 A：用TNF處理的MV和對照組MV治療軟骨細胞在細胞外基質的積累上并無差別。B：我們測量了上清液中酶促裂解的sGAG，發(fā)現(xiàn)IL-1β治療后會引起更多的蛋白多糖釋放。

圖3 C：軟骨的IL-1β治療會引起ACAN 和COL2A1（兩種zui豐富的軟骨基質蛋白）和SOX9（驅動其表達的轉錄因子）的表達減少；D：與MV共培養(yǎng)后也出現(xiàn)了不同分子量的條帶。

圖3 E：無論是MV Ctrl還是MV TNF都顯著降低了IL-8（約30％降低）和PGE2（> 80％抑制）的釋放；F：高水平的IL-1β（50毫微克/毫升）增加了C28/ I2軟骨細胞凋亡。

圖3 G：IL-1β治療后TGFB1表達下調約2倍，而與MVTNF細胞共培養(yǎng)后明顯上調了，不論有沒有經過IL-1β治療。H：嗜中性粒細胞MVTNF中共培養(yǎng)時，阻斷TGF-β導致中性粒細胞合成代謝的顯著降低（？50％）。

圖4：MV在體內和體外環(huán)境下進入軟骨，傳遞AnxA1。

圖4 A：我們觀察到MV到達軟骨細胞的遷移，在兩種外植體中都能發(fā)現(xiàn)。B：然而相比之下，IL-1β刺激的外植體遷移的距離更遠。C：與*是MV TNF相比，MVTNF與IL-1β共同作用減少了sGAG的缺失。

圖4 D：IL-1β處理的大鼠軟骨外植體與MV TNF共培養(yǎng)的標本用AnxA1染色。

圖4 E：將軟骨外植體與MDM來源（CD14+）的MV共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)缺少軟骨的滲透，甚至只黏附在關節(jié)表面，而中性粒細胞來源（CD66b+）的MV可以滲透進基質中。

圖4 F：小鼠腕部的標本，用MRP14和DAPI染色。

圖5：MV引起的軟骨保護需要AnxA1和其受體FRP2/ALX。

圖5  A、B：用ECM沉積標準化為DNA含量，比較野生型和Anxa1缺失型小鼠在IL-1β和MV TNF處理下的DNA含量。C：在C28/I2 微團中FPR2/ALX表達。

圖5 D ：電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，內源性的FPR2/ALX和AnxA1在軟骨細胞中存在，并頻繁地共同結合。

圖5 E：IL-1b的降解效果在所有動物的軟骨外植體都類似。F：C28/I2微團的上清液中全部的TGF-b1含量。

圖6：在炎癥性關節(jié)炎模型中中性粒MV保護軟骨的退化。

圖6 （A、B、C）：ANXA1和FPR2/ALX可以保護嗜中性粒細胞的MV的性能。作者通過建立炎癥模型去驗證之前的結論。

好啦今天的文獻就解讀到這里，下面是問答環(huán)節(jié)：

我們應怎樣利用這些微泡為類風濕關節(jié)炎的患者提供更好的治療方向？

首先這些微泡本身具有治療關節(jié)炎癥的效果，加強微泡的釋放可以加強治療；此外它是罕見的可以穿透軟骨的物質，我們可以利用微泡包裹藥物穿透軟骨進行治療，這篇文章的發(fā)現(xiàn)對后續(xù)治療的研發(fā)價值很大