摘 要：本文旨在介紹使用軟件設(shè)計(jì)PCR引物的技巧。在pcr引物設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了兩種常用引物設(shè)計(jì)軟件的基本使用方法，并對(duì)其各自的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。一般性引物自動(dòng)搜索可采用“Premier Primer 5”軟件，而引物的評(píng)價(jià)分析則可采用“Oligo 6”軟件。
關(guān)鍵詞：PCR；引物設(shè)計(jì)

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自從1985年Karny Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來(lái)，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多、zui廣泛的手段之一[1] ，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。一般來(lái)說(shuō)，專(zhuān)門(mén)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)的專(zhuān)業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來(lái)卻不太容易。本文將就引物設(shè)計(jì)原則及軟件使用問(wèn)題進(jìn)行探討。

1. 引物設(shè)計(jì)的原則
引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length），產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：
1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[2] 。
2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件zui。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（值不超過(guò)9），而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)[6] 。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。
8. 對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。

摘 要：本文旨在介紹使用軟件設(shè)計(jì)PCR引物的技巧。在pcr引物設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了兩種常用引物設(shè)計(jì)軟件的基本使用方法，并對(duì)其各自的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。一般性引物自動(dòng)搜索可采用“Premier Primer 5”軟件，而引物的評(píng)價(jià)分析則可采用“Oligo 6”軟件。
關(guān)鍵詞：PCR；引物設(shè)計(jì)

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自從1985年Karny Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來(lái)，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多、zui廣泛的手段之一[1] ，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。一般來(lái)說(shuō)，專(zhuān)門(mén)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)的專(zhuān)業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來(lái)卻不太容易。本文將就引物設(shè)計(jì)原則及軟件使用問(wèn)題進(jìn)行探討。

1. 引物設(shè)計(jì)的原則
引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length），產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：
1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[2] 。
2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件zui。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（值不超過(guò)9），而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)[6] 。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。
8. 對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。