1、存放:超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞必須從干冰運(yùn)送包裝箱取出直接放入–80°C冰箱的底部.一定不要用液氮來(lái)存感受態(tài)細(xì)胞.

1)存放條件:超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)微小的溫度改變也極度敏感,因此必須存放在–80°C冰箱的底部.即使是將細(xì)胞從一個(gè)冰箱轉(zhuǎn)移到另一個(gè)冰箱也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的損失.采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圓底試管:在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用圓底14-ml BD Falcon聚丙烯試管(貨號(hào) #352059)也是關(guān)鍵之一.一般的試管容易被b-巰基乙醇降解.而極為重要的熱激步驟的操作也是根據(jù)這種型號(hào)的試管優(yōu)化的.

2)分裝細(xì)胞:分裝細(xì)胞時(shí)務(wù)必保持置于冰上.將聚丙烯管放置在冰上等待細(xì)胞融化,分裝的細(xì)胞裝入預(yù)冷的試管中.而且,每次轉(zhuǎn)化都用100 ml細(xì)胞也很重要,減少細(xì)胞體積必定減少轉(zhuǎn)化效率.

2、使用b-巰基乙醇(b-ME): 已經(jīng)證明b-ME可以幫助提高轉(zhuǎn)化效率.StrataGENE提供的b-ME已經(jīng)過(guò)稀釋,可以直接使用.其它來(lái)源的b-ME使用時(shí)請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn).

3、使用NZY+ 肉湯: Stratagene的超級(jí)、感受態(tài)細(xì)胞在熱激處理后用NZY+ 培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng).用其它培養(yǎng)基替代往往會(huì)造成效率降低.

4、DNA的質(zhì)量和用量:測(cè)定的zui高轉(zhuǎn)化效率的數(shù)值來(lái)自1 ml的0.01 ng/ml超螺旋pUC18 DNA轉(zhuǎn)化100 ml 感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物時(shí),每100 ml細(xì)胞要求2 ml連接反應(yīng)產(chǎn)物.通過(guò)使用50 ng DNA可以得到更多的克隆,但同時(shí)轉(zhuǎn)化效率(cfu/mg) 有所降低.DNA溶液的體積可以增至總轉(zhuǎn)化體系體積的10%,但是轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)降低.熱激時(shí)間和溫度: *的轉(zhuǎn)化結(jié)果是采用42°C熱激30秒.熱激40秒均造成效率降低.溫度不可超過(guò)42°C.

5、 藍(lán)-白斑篩選: 特定重組質(zhì)粒的藍(lán)白斑篩選要求宿主菌含有F?附加體上的lacIqZ*M15 基因,而質(zhì)粒提供a-互補(bǔ)(例如Stratagene的pBluescript? II系列載體等).當(dāng)iptg誘導(dǎo)lacZ表達(dá)時(shí),在含有發(fā)色底物X-gal的平板上,帶有插入片段的重組質(zhì)粒的克隆為白色,帶有質(zhì)粒卻沒(méi)有插入片段的克隆則為藍(lán)色.做藍(lán)白斑篩選時(shí),將含有IPTG和X-gal LB瓊脂糖平板在37°C下培養(yǎng)17小時(shí)以上以便顯色.顯色后將平板置于4°C兩小時(shí),藍(lán)色會(huì)加深.如果插入片段毒性較大,應(yīng)采用沒(méi)有X-gal and IPTG的培養(yǎng)平板.藍(lán)白斑篩選雖然沒(méi)辦法做了,但是在沒(méi)有IPTG時(shí),毒蛋白或許有一定的表達(dá).