聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸擴(kuò)增的有效工具，由于其靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)上已廣泛應(yīng)用與病毒、細(xì)菌病原體及遺傳病、腫瘤的早期診斷。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，特別是病毒或腫瘤的治療監(jiān)測(cè)、疾病的診斷、機(jī)體基因表達(dá)調(diào)控方面，不僅需要檢測(cè)其存在是否；而且還需要得知擴(kuò)增前標(biāo)本中的模板的數(shù)量，因而必須對(duì)PCR進(jìn)行定量檢測(cè)，即定量pcr技術(shù)，本文將對(duì)定量PCR的定量原理、技術(shù)類(lèi)型以及相關(guān)進(jìn)展方面綜述如下：

一、 定量PCR的基本原理：
在PCR實(shí)驗(yàn)條件下（Mg++、緩沖液、Taq酶、dNTP、引物、模板），經(jīng)變性→退火→延伸的一個(gè)循環(huán)，引物在退火階段與相應(yīng)的模板結(jié)合，在延伸階段進(jìn)行復(fù)制，此時(shí)產(chǎn)物為：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n個(gè)PCR循環(huán)后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)；Yn-1:為n-1個(gè)熱循環(huán)后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)；Ev:為擴(kuò)增效率,0≤Ev≤1；若n個(gè)熱循環(huán)中其Ev是一致的話，經(jīng)n個(gè)循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)（Y）和反應(yīng)物中原始分子數(shù)（X）之間關(guān)系，可描述為：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 終點(diǎn)法定量原理：
在實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同的前提下，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量可以計(jì)數(shù)出反應(yīng)物中原始分子數(shù)，若核酸提取效率相同（與標(biāo)準(zhǔn)品），進(jìn)而計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：
lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù))
2. 實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理：
在實(shí)驗(yàn)、相同Ev以及相同擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下，反應(yīng)物中原始分子數(shù)（X）與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)（n）成反比，若核酸提取效率相同（與標(biāo)準(zhǔn)品），進(jìn)而計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b為常數(shù))3. 擴(kuò)增效率（Ev）的影響因素：
以上所述的定量原理均假定反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率是不變，但是，實(shí)際上，Ev在不同的擴(kuò)增管之間和同一擴(kuò)增管的不同循環(huán)次數(shù)之間是不同，如何控制及解決Ev的變異以及標(biāo)本制備的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的發(fā)展方向，那么，Ev的影響因素有：
a. 引物和靶序列的結(jié)合能力（G+C%及突變），擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，G+C含量。
b. 模板的含量、DNA聚合酶、反應(yīng)液成分變化。
c. 不同臨床標(biāo)本間DNA聚合酶抑制物的存在情況。
d. 循環(huán)擴(kuò)增儀上不同位置的差異。

二、 定量PCR方法的分類(lèi)：
目前對(duì)標(biāo)本的靶DNA或基因的相對(duì)或含量是不同樣品的PCR產(chǎn)量檢測(cè)而推算出來(lái)，根據(jù)標(biāo)本中是否加入內(nèi)標(biāo)物，將分成以下兩種：

（一） 外標(biāo)法定量PCR：
一個(gè)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品（通常用質(zhì)粒）經(jīng)一系列的稀釋后與待檢標(biāo)本一起進(jìn)行擴(kuò)增，制作PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和靶核酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待檢標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物量即可推算出靶核酸的含量；上述已提及不同標(biāo)本間的擴(kuò)增效率（Ev）的差異，對(duì)樣本間PCR產(chǎn)量作比較會(huì)產(chǎn)生很不準(zhǔn)確的結(jié)果；以外還應(yīng)考慮“平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)結(jié)果的影響，因?yàn)?/span>“平臺(tái)期”PCR產(chǎn)物量并不受初時(shí)模板量的影響；導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性差，因此采用外標(biāo)法應(yīng)該注意：
a、 注意標(biāo)準(zhǔn)化操作，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，減少標(biāo)本間Ev的差異導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的影響。
b、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋因存在隨機(jī)分布而導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。
c、 注意“平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。特別是后面提及的終點(diǎn)法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的方法中。
d、 由PCR方法很靈敏，特別RT-PCR方法，沒(méi)有內(nèi)標(biāo)存在的情況下，標(biāo)本的污染而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。
e、 標(biāo)本處理對(duì)結(jié)果的影響。

（二） 內(nèi)標(biāo)法定量PCR：
由于上述提及的外標(biāo)法存在不同標(biāo)本間的Ev差異和標(biāo)本的提?。ㄌ貏e是RT-PCR）的微小變化都將導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的巨大差異。為了清除此種影響，國(guó)內(nèi)外都推重采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法是用PCR技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量的基礎(chǔ)和今后的發(fā)展方向，根據(jù)采用內(nèi)標(biāo)品的不同，又分為非競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和競(jìng)爭(zhēng)定量PCR（competitive quantitative PCR）