摘要：RNA 干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA 所引起的序列特異性基因沉默。它是真核生物中基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用的重要機(jī)制之一。RNAi 技術(shù)作為新興的基因阻抑方法，在功能基因組學(xué)、微生物學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文就其作用機(jī)制、基本實(shí)驗(yàn)程序及注意事項(xiàng)作了較詳細(xì)的綜述，對(duì)其存在的相關(guān)問題和前景亦做了展望。
關(guān)鍵詞：RNAi；sirna；轉(zhuǎn)染
小RNA 作用與應(yīng)用研究繼2001，2002 連續(xù)兩年被美國(guó)science 雜志評(píng)為年度10 大突破技術(shù)以來(lái)，近年來(lái)繼續(xù)熱度高漲，名列前矛。其核心技術(shù)RNA 干擾（RNAi），即用20 多個(gè)核苷酸組成的短的雙鏈RNA（siRNA）代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域，不僅如此，它還為基因治療開辟了新的途徑。此外，RNAi 沉默機(jī)制的探索也取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。目前，在大致勾畫出生物體內(nèi)源性小RNA 的重要作用框架后，進(jìn)一步闡述其作用細(xì)節(jié)、探索小RNA 對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控、如何利用RNAi 進(jìn)行疾病防治等等都成為生物學(xué)家研究的一大熱點(diǎn)。

1、 RNAi 的作用機(jī)制

通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA 干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA 被切割為21-23 核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs)。證據(jù)表明;一個(gè)稱為Dicer 的酶，是RNase III 家族中特異識(shí)別雙鏈RNA 的一員，它能以一種ATP 依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA 降解為19-21bp 的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2 個(gè)堿基突出。在RNAi 效應(yīng)階段，siRNA 雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC 需要一個(gè)ATP 依賴的將小分子RNA 解雙鏈的過程。激活的RISC 通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA 轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12 個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC 都包含一個(gè)siRNA 和一個(gè)不同于Dicer 的RNA 酶。另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA 在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt 長(zhǎng)的片段，這種dsRNA 可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA 序列甲基化，從而使啟動(dòng)子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理見（圖1）：
RNA 干擾(RNAi)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相關(guān)探討
圖1、RNAi 的作用機(jī)制

2、RNAi 基本試驗(yàn)程序及注意事項(xiàng)
2.1、 siRNA 的設(shè)計(jì)
2.1.1、目標(biāo)序列的篩選
在設(shè)計(jì)RNAi 實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：
http://www.genesil。。ｃｏｍ/business/products/order2.htm
http://www.ambion。。ｃｏｍ/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.1.2、RNAi 目標(biāo)序列的選取原則
RNAi 目標(biāo)序列的選取原則應(yīng)遵循以下幾個(gè)方面的原則：(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3"端的19 個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC 含量在45%—55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更為有效。Tuschl 等建議在設(shè)計(jì)siRNA 時(shí)不要針對(duì)5"和3"端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA 從而影響siRNA 的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） (3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。
2.1.3、陰性對(duì)照
一個(gè)完整的siRNA 實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA 應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA 沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA 序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。