在人細(xì)胞中快速、高水平地表達(dá)目的蛋白

在2至3個(gè)星期內(nèi)即可獲得價(jià)的病毒

無(wú)需噬斑純化

靶細(xì)胞可以是分裂或不分裂的細(xì)胞（dividing/or nondividing cell）

CLONTECH的Adeno-X?表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)特別

的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，用于在人細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)目的蛋白質(zhì)。由于Adeno-X?病毒DNA中含有特別設(shè)計(jì)的克隆位點(diǎn)，你可以在2星期內(nèi)獲得價(jià)的腺病毒，其效率遠(yuǎn)高于其他腺病毒系統(tǒng)。

表達(dá)目的蛋白質(zhì)

腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以在人細(xì)胞中zui高水平地表達(dá)目的蛋白質(zhì) (1)。因?yàn)楹康幕虻闹亟M腺病毒DNA是游離于細(xì)胞基因組外的 (不整合入宿主基因組)，所以目的蛋白質(zhì)得到瞬時(shí)的高水平表達(dá)。更重要的是利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)可以將外源基因轉(zhuǎn)到分裂及不分裂的細(xì)胞中表達(dá)。

下表比較了腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的特點(diǎn)。這兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是互補(bǔ)的，選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)，就可以把目的基因轉(zhuǎn)入任何種類的人細(xì)胞。如果需要瞬時(shí)、高水平地表達(dá)蛋白質(zhì)，那么腺病毒表達(dá)系統(tǒng)是*的選擇.

構(gòu)建重組腺病毒簡(jiǎn)單快捷

構(gòu)建重組腺病毒的兩種傳統(tǒng)方法是以同源重組為基礎(chǔ)的。其一是用修飾的腺病毒DNA與穿梭載體在HEK 293細(xì)胞中進(jìn)行同源重組；更為流行的方法采用了穿梭載體與腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一種特殊的菌株(BJ 5183)。然后從細(xì)菌中收集重組腺病毒，用其感染HEK 293細(xì)胞。雖然這些方法是可行的，但由于在HEK 293細(xì)胞中同源重組率偏低；或在轉(zhuǎn)化BJ 5183之前克隆步驟過(guò)于復(fù)雜，使這兩種方法效率偏低(下表)。

以體外連接方法為基礎(chǔ) (by Mizuguchi和Kay)，CLONTECH的Adeno-X?表達(dá)系統(tǒng)提供了一種快速、構(gòu)建重組腺病毒的方法。只需4至7天就可以獲得重組腺病毒，如圖1所示。由于經(jīng)過(guò)7天的培養(yǎng)之后HEK 293細(xì)胞會(huì)漸漸失去對(duì)培養(yǎng)皿的附著而擴(kuò)散，導(dǎo)致噬斑融合，用傳統(tǒng)方法制備重組腺病毒往往需要鋪平板以防止細(xì)胞擴(kuò)散。而用CLONTECH的Adeno-X?表達(dá)系統(tǒng)只需4至7天即可得到純的重組腺病毒，這意味著無(wú)需鋪瓊脂糖平板。

Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)含有一種小而便捷的穿梭載體―pShuttle，用于克隆目的基因。這種載體的表達(dá)框兩側(cè)含有極的限制性酶切位點(diǎn)―PI-SceⅠ和I-CeuⅠ。Adeno-X病毒DNA也含有上述兩個(gè)位點(diǎn)。只需把目的基因插入pShuttle的多克隆位點(diǎn)，然后用PI-SceⅠ和I -CeuⅠ消化載體，再將含有目的基因的pShuttle片段與Adeno-X病毒DNA(經(jīng)PI-SceⅠ和I-CeuⅠ預(yù)消化為線形DNA)連接。為了提高篩選效率，用SwaⅠ酶切連接產(chǎn)物以除去自身環(huán)化或者其他可能存在的非線性的腺病毒DNA（SwaⅠ酶切位點(diǎn)在環(huán)狀A(yù)deno-X病毒DNA的PI-SceⅠ和I-CeuⅠ位點(diǎn)之間）。用此DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并篩選重組子。zui后，用重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK 293病毒包裝細(xì)胞系。由于從Adeno-X病毒DNA中刪除了E1基因，使其無(wú)法感染細(xì)胞，這一步需要用HEK 293包裝細(xì)胞提供反式的E1蛋白，即可得到含有目的基因、有感染能力的重組腺病毒。

感染

在人原代成纖維細(xì)胞(BJ細(xì)胞)中，用Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)高水平表達(dá)β-半乳糖苷酶。未純化的重組腺病毒含有來(lái)自于HEK 293細(xì)胞的lacZ基因，用于直接感染BJ細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，48小時(shí)后染色。結(jié)果顯示，被感染的細(xì)胞高水平地表達(dá)β-半乳糖苷酶。若使用純化腺病毒(氯化銫離心可產(chǎn)生1012pfu/ml的效價(jià))，可獲得更高的蛋白質(zhì)表達(dá)。這不但對(duì)于更高水平的表達(dá)有用，且對(duì)于需要用更價(jià)的腺病毒進(jìn)行感染的細(xì)胞類型也有意義。

容易篩選

體外連接方法減少了非重組腺病毒的產(chǎn)生，且無(wú)需進(jìn)行費(fèi)時(shí)的噬斑純化。由于SwaⅠ消化可以消除由非線性的Adeno-X病毒DNA引起的背景，因此大多數(shù)的轉(zhuǎn)化克隆含有重組腺病毒DNA。

重組腺病毒感染許多人細(xì)胞類型

腺病毒可效感染多種類型的靶細(xì)胞，包括除造血細(xì)胞之外所有的人細(xì)胞類型。因此，Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)可用于多種研究用途，例如：基因治療研究，基因功能分析，反義治療，研制疫苗和某些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。

安全操作腺病毒

E1的缺失可幫助確定重組腺病毒不具感染性，我們?nèi)酝扑]使用P2 facility以及其下的標(biāo)準(zhǔn)安全步驟。腺病毒可通過(guò)加熱或照射紫外線使其失去活性。

完整的基因表達(dá)系統(tǒng)

Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)包括可連接的Adeno-X病毒DNA，pShuttle載體，PI-SceⅠ和I-CeuⅠ以及雙消化緩沖液。我們同樣提供僅包含線形化的Adeno-X病毒DNA或雙消化緩沖液和酶的附屬試劑盒用于補(bǔ)充基礎(chǔ)系統(tǒng)。