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一、目的

     學(xué)習(xí)原代培養(yǎng)方法，從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。

二、概述

     組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。可以采用剪切法，即將組織塊剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，組織小塊貼壁24h或更長(zhǎng)時(shí)間后，細(xì)胞就從組織四周游出。但由于在反復(fù)剪切和接種過程中對(duì)組織塊的損傷，并不是每個(gè)小塊都能長(zhǎng)出細(xì)胞。用于組織塊培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的需要作適當(dāng)處理，如預(yù)先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細(xì)胞等的生長(zhǎng)。（本節(jié)以新生牛主動(dòng)脈平滑肌培養(yǎng)為例）

三、材料

（一）儀器

1.凈化工作臺(tái)

2.恒溫水浴箱

3.冰箱（4℃、-20℃）

4.倒置相差顯微鏡

5.培養(yǎng)箱

（二）玻璃器皿

1.培養(yǎng)皿（Φ100mm）

2.吸管（彎頭）

3.燒杯（500ml、200ml、10ml）

4.廣口試劑瓶（500ml）

5.玻璃瓶（250ml、100ml）

6.培養(yǎng)瓶

7.廢液缸

（三）塑料器皿

1.吸頭

2.槍頭

3.膠塞

4.EP管

（四）其他物品

1.微量加樣槍

2.眼科組織剪（直尖、彎）

3.眼科組織鑷（直、彎）

4.12.5cm組織鑷（無鉤、1×2鉤）

5.25cm敷料鑷（無鉤）

6.止血鉗（18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式）

7.解剖剪

（五）試劑

1.D-Hanks液

2.小牛血清

3.RPMI1640

4.雙抗（青霉素、鏈霉素）

5.1N HCl

6. 7.4%NaHCO3

四、操作步驟

1.取材：打開胸腔，無菌操作下取出主動(dòng)脈胸段，浸到預(yù)先配制好的含雙抗（500u/ml青、鏈酶素）的D-Hanks液中漂洗。                                                                                                                               

2.組織的沖洗、修剪：取出主動(dòng)脈，用鋒利的剪刀修剪除去周圍組織，再用D-Hanks沖洗主動(dòng)脈3次，除去血kuai及雜組織等。

3.平滑肌組織分離：縱向剖開主動(dòng)脈，撕下主動(dòng)脈內(nèi)層，取主動(dòng)脈中層的平滑肌組織，無血清RPMI1640漂洗3次。

4.剪切：將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復(fù)剪切至剪成1mm3小塊，在剪切過程中，可以適當(dāng)向組織中滴加1～2滴培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)。

5.貼塊：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用彎頭吸管將組織塊均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右，組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)注入適量含10%牛血清培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋。

6.培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶瓶底朝上，37℃培養(yǎng)箱放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。

7.換液：原代培養(yǎng)3～5d，需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。   

      組織塊培養(yǎng)法也可不用翻轉(zhuǎn)法，即在擺放組織塊后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)僅加入少量培養(yǎng)液，以能保持組織塊濕潤(rùn)即可，蓋好瓶蓋，放置37℃培養(yǎng)箱24h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。

注意事項(xiàng)

1.取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應(yīng)切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24h。

2.從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區(qū)域取材，可用含500～1000u/ml的青、鏈霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡10min再作培養(yǎng)。

3. 組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。

4. 原代培養(yǎng)的1～2d內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除。