支原體肉湯基礎(chǔ)（Frey）特殊培養(yǎng)法

二倍體細胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為：

1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2.用溫BSS沖洗1次。

3.用0.25%溫*消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可；作用1~5分鐘。

4.待細胞附著松動、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5.輕輕反復(fù)吹打制成單個細胞懸液。

6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法：

1.取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞，90%匯合時制成細胞懸液，再按105細胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2.在細胞半?yún)R合時，準備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/106細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3.細胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時，*消化細胞制成懸液，按5×104（104細胞/cm2）接種入新支原體肉湯基礎(chǔ)（Frey）中。

4.48小時后，即可用于細胞克隆之用。

支原體肉湯基礎(chǔ)（Frey）細胞分離（克隆）培養(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆細胞，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

2.低密度細胞懸液的制備：做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液，然后稀釋細胞，使之成為1~2細胞/毫升懸液，zui適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養(yǎng)液。

3.接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時要迅速準確，爭取在zui短時間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

4.標記：培養(yǎng)6~12小時后，待細胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀察和標記下含有單個細胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細胞增至500~600個時，可進行分離培養(yǎng)。

5.分離擴大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加*少許，加入量已能覆蓋細胞群即可，如過多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細胞變圓時，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

支原體肉湯基礎(chǔ)（Frey）相關(guān)產(chǎn)品如下：hz0280    人膠質(zhì)瘤細胞    U251
hz0281    人膠質(zhì)母細胞瘤細胞    A172
hz0282    人惡性黑色素瘤細胞    A-375
hz0283    人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞    CCRF-CEM [CCRF CEM]
hz0284    人Ph+急淋白血病細胞系    SUP-B15
hz0285    人組織細胞淋巴瘤細胞    U-937
hz0286    人B淋巴母細胞    HMy2.CIR
hz0287    人Burkitt's淋巴瘤細胞    NAMALWA
hz0288    人Burkitt's淋巴瘤細胞    Raji
hz0289    人EB病毒轉(zhuǎn)化的B細胞    CGM1
hz0290    人T淋巴細胞白血病細胞    A3
hz0291    人T淋巴細胞白血病細胞    HuT 78
hz0292    人T淋巴細胞白血病細胞    Jurkat, Clone E6-1
hz0293    人T細胞白血病細胞    6T-CEM
hz0294    人巨核細胞白血病細胞    Dami
hz0295    人慢性髓原白血病細胞    K-562
hz0296    人紅白細胞白血病細胞    HEL
hz0297    人紅白血病細胞    Kasumi-1
hz0298    人外周血嗜堿性白血病細胞    KU812
hz0299    人急性非B非T淋巴細胞白血病    Reh
hz0300    人急性淋巴母細胞白血病細胞    MOLT-4 
hz0301    人成巨核細胞白血病細胞    MEG-01
hz0302    人成巨核細胞白血病細胞    Daudi
hz0303    人單核細胞白血病    THP-1
hz0304    人原髓細胞白血病細胞    HL-60
hz0305    人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞,    NK-92
hz0306    人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞,    NK-92MI
hz0307    人套細胞淋巴瘤細胞    JeKo-1
hz0308    小鼠X小鼠    PK136
hz0309    小鼠神經(jīng)細胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤之融合細胞    NG108-15 [108CC15]
hz0310    雜交瘤細胞CD25    PC 61 5.3 [PC 61; PC 61.5.3]
hz0311    中國倉鼠X小鼠B淋巴細胞雜交瘤    MR1 [derivative of HB-11048]
hz0312    雜交瘤細胞抗AChE    AE-1
hz0313    雜交瘤細胞抗AChE    AE-2
hz0314    雜交瘤細胞抗CD2    OKT 11
hz0315    雜交瘤細胞抗CD2    35.1
hz-1101    DU145(前列腺癌細胞)