TSN 瓊脂特殊培養(yǎng)法

二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序?yàn)椋?/span>

1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2.用溫BSS沖洗1次。

3.用0.25%溫*消化，加入消化液量以僅覆蓋細(xì)胞層即可；作用1~5分鐘。

4.待細(xì)胞附著松動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細(xì)胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5.輕輕反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

使用飼細(xì)胞(Feeder Cells)。制備方法：

1.取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90%匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按105細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2.在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/106細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3.細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時(shí)，*消化細(xì)胞制成懸液，按5×104（104細(xì)胞/cm2）接種入新TSN 瓊脂中。

4.48小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。

TSN 瓊脂細(xì)胞分離（克?。┡囵B(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆細(xì)胞，吸出瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

2.低密度細(xì)胞懸液的制備：做克隆細(xì)胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后稀釋細(xì)胞，使之成為1~2細(xì)胞/毫升懸液，zui適宜細(xì)胞密度為1~2細(xì)胞/ml培養(yǎng)液。

3.接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在zui短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

4.標(biāo)記：培養(yǎng)6~12小時(shí)后，待細(xì)胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含有單個(gè)細(xì)胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無(wú)需換液，只有在細(xì)胞增長(zhǎng)過(guò)于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過(guò)多，余少許，以免細(xì)胞干涸。然后再迅速補(bǔ)加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500~600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行分離培養(yǎng)。

5.分離擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加*少許，加入量已能覆蓋細(xì)胞群即可，如過(guò)多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞離開(kāi)底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補(bǔ)加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細(xì)胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

TSN 瓊脂相關(guān)產(chǎn)品如下：

hz0045    中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞,CHL/IU [ CHL-11 ]細(xì)胞
hz0046    中國(guó)倉(cāng)鼠二氫*還原酶缺陷細(xì)胞,CHO/dhFr-細(xì)胞
hz0047    中國(guó)倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株 CHO-K1細(xì)胞
hz0048    中國(guó)倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠肺細(xì)胞,R1610細(xì)胞
hz0049    中國(guó)倉(cāng)鼠X小鼠B淋巴細(xì)胞雜交瘤 MR1細(xì)胞,
hz0050    致病性大腸埃希氏菌
hz0051    植物乳桿菌
hz0052    正常小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞,TM4細(xì)胞
hz0053    正常小鼠睪丸Leydig細(xì)胞,TM3細(xì)胞
hz0054    正常人肝細(xì)胞,L-02細(xì)胞
hz0055    正常大鼠腎細(xì)胞,NRK細(xì)胞
hz0056    整合SV40 基因的乳腺上皮細(xì)胞,HBL-100細(xì)胞
hz0057    赭曲霉
hz0058    赭綠青霉
hz0059    沼澤紅假單胞菌
hz0060    張氏肝細(xì)胞,HeLa [ Chang Liver ]細(xì)胞
hz0061    粘質(zhì)沙雷氏菌
hz0062    粘質(zhì)沙雷伯氏菌
hz0063    粘紅酵母
hz0064    早代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,MEF細(xì)胞
hz0065    暫不提供 A-kata(+)細(xì)胞
hz0066    雜色曲霉
hz0067    雜交瘤細(xì)胞枝原體陽(yáng)性 B6YH4細(xì)胞
hz0068    雜交瘤細(xì)胞抗CD2 OKT 11細(xì)胞
hz0069    雜交瘤細(xì)胞抗CD2 35.1細(xì)胞
hz0070    雜交瘤細(xì)胞抗AChE AE-1細(xì)胞,
hz0071    雜交瘤細(xì)胞CD25 PC 61 5.3 細(xì)胞
hz0072    雜交瘤(抗CD3) OKT3細(xì)胞
hz0073    運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌